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Aug 05, 2023

Vaccine

Volume Communication Nature

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 1770 (2023) Citer cet article

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L'évolution dirigée dans des systèmes d'affichage bactériens ou de levure a été utilisée avec succès pour améliorer la stabilité et l'expression des récepteurs couplés aux protéines G pour des études structurelles et biophysiques. Pourtant, plusieurs récepteurs ne peuvent pas être abordés dans les systèmes microbiens en raison de leur composition moléculaire complexe ou de leurs propriétés de ligand défavorables. Nous rapportons ici une approche pour faire évoluer les récepteurs couplés aux protéines G dans les cellules de mammifères. Pour obtenir une clonalité et une expression uniforme, nous développons un système de transduction virale basé sur le virus de la vaccine. Par une conception rationnelle des bibliothèques d'ADN synthétiques, nous développons d'abord le récepteur de la neurotensine 1 pour une stabilité et une expression élevées. Deuxièmement, nous démontrons que les récepteurs avec des architectures moléculaires complexes et de grands ligands, tels que le récepteur de l'hormone parathyroïdienne 1, peuvent être facilement évolués. Il est important de noter que les propriétés fonctionnelles des récepteurs peuvent désormais évoluer en présence de l'environnement de signalisation des mammifères, ce qui se traduit par des variants de récepteurs présentant un couplage allostérique accru entre le site de liaison du ligand et l'interface de la protéine G. Notre approche donne ainsi un aperçu de l'interaction moléculaire complexe requise pour l'activation du GPCR.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) constituent la plus grande famille de protéines membranaires intégrales et sont impliqués dans la régulation de nombreux processus biologiques1. Les GPCR détectent une grande variété de ligands, allant des petites molécules aux grosses protéines, de leur côté extracellulaire. Pour exercer leur fonction, les GPCR échantillonnent un continuum d'états conformationnels, résultant en des niveaux d'aucune activité à une activité maximale. Les ligands stabilisent des conformations distinctes qui maintiennent le récepteur soit dans un état inactif (dans le cas des agonistes inverses), soit dans un état actif (dans le cas des agonistes)2. Le changement conformationnel induit par un agoniste au niveau de la poche de liaison du ligand est transmis à la surface intracellulaire du récepteur et entraîne l'activation des protéines G hétérotrimériques par échange de GDP contre GTP dans la sous-unité Gα. En conséquence, les sous-unités Gα et Gβγ se dissocient et peuvent activer les processus de signalisation en aval3,4. Compte tenu de leur large pertinence physiologique, les GPCR sont des cibles médicamenteuses importantes1, et la compréhension des mécanismes structure-fonction conduisant à l'activation des GPCR est essentielle pour le développement futur de médicaments. Alors que la flexibilité conformationnelle est essentielle pour le bon fonctionnement des récepteurs, c'est un obstacle pour déterminer expérimentalement les structures des protéines. Cela a été la motivation des efforts d'ingénierie substantiels pour rendre les GPCR accessibles aux études structurelles.

Nous avons déjà conçu plusieurs stratégies utilisant l'évolution dirigée pour améliorer les propriétés biophysiques des RCPG5,6,7,8. L'évolution dirigée vise à accélérer le processus d'évolution naturelle, c'est-à-dire l'enrichissement des traits souhaitables qui sont encodés dans un pool de variants génétiques, au moyen de cycles itératifs de diversification et de sélection de gènes. Ainsi, la fonction des protéines peut être modifiée ou créée de novo, et ainsi, l'évolution dirigée est devenue une méthode puissante pour développer de nouveaux outils moléculaires et thérapeutiques, mais principalement appliquée aux protéines solubles. Pour étendre cette méthodologie aux GPCR, des organismes microbiens tels que des bactéries et des levures ont été utilisés. Par transformation avec des plasmides, ils peuvent prendre en moyenne une copie, de sorte qu'après que le plasmide ait établi son nombre de copies, chaque cellule microbienne est toujours "clonale". L'expression des GPCR sous forme fonctionnelle dans la membrane plasmique de la levure ou la membrane interne d'E. De plus, des taux de transformation élevés peuvent être atteints dans les microbes pour représenter efficacement diverses bibliothèques de gènes. En utilisant la sélection pilotée par le nombre de récepteurs de liaison au ligand et donc fonctionnels dans la membrane, une variété de variantes de GPCR stables et bien exprimées ont été générées qui ont joué un rôle déterminant dans les études structurelles et les projets de découverte de médicaments10,11,12,13,14,15,16,17.

Bien que l'efficacité de la manipulation et la génération de bibliothèques dans les bactéries et les levures soient bien adaptées, certaines limitations fondamentales accompagnent les systèmes d'expression microbienne en ce qui concerne leur applicabilité aux protéines membranaires. La membrane plasmique des microbes est généralement protégée par une membrane externe ou une paroi cellulaire de sorte que le site de liaison au ligand des récepteurs n'est pas facilement accessible depuis le côté extracellulaire, en particulier pour les ligands plus gros. Des protocoles de perméabilisation efficaces ont été conçus pour rendre ces barrières externes perméables aux petites molécules et aux ligands peptidiques courts5,6,8, mais des molécules plus volumineuses telles que les hormones peptidiques ou les protéines peuvent ne pas atteindre facilement leur site de liaison au niveau du récepteur. En outre, de nombreux GPCR sont hautement toxiques pour les bactéries et les cellules de levure, ce qui limite le nombre de cibles potentielles à faire évoluer, car un minimum d'expression basale est requis pour la sélection. Enfin, la fonction du récepteur, c'est-à-dire le potentiel de signalisation aux effecteurs en aval, ne peut pas être facilement abordée dans les systèmes microbiens car les cascades de signalisation endogènes manquent complètement (dans le cas des bactéries) ou ne sont présentes qu'à une fonctionnalité très réduite (dans le cas de la levure). Par conséquent, l'évolution des GPCR dans les systèmes microbiens a jusqu'à présent été limitée pour améliorer l'expression et la stabilité des récepteurs, sans ouvrir encore la possibilité d'appliquer le potentiel d'évolution dirigée pour explorer les aspects fonctionnels de la signalisation des GPCR.

En revanche, dans les cellules de mammifères, de telles limitations n'existent pas et, par conséquent, les systèmes d'affichage de mammifères peuvent ouvrir de nouvelles possibilités pour les combinaisons ligand-récepteur. Traduire la facilité de création de grandes bibliothèques du système d'affichage microbien aux cellules de mammifères, cependant, a été difficile. De nombreuses tentatives pour créer des bibliothèques de mammifères se sont appuyées sur des vecteurs lentiviraux à de faibles multiplicités d'infection18. Ils sont dérivés du génome du VIH et leur génome est inséré dans le génome de l'hôte. Bien que cela créerait des bibliothèques stables, cette approche présente des inconvénients considérables : la diversité maximale de la bibliothèque est limitée, le point d'insertion détermine le niveau d'expression au moins autant que le phénotype du mutant, le niveau d'expression sera faible car le nombre de copies du gène est très faible et l'identification des mutants protéiques est plutôt fastidieuse, car l'ADN ne peut être obtenu qu'à partir d'une PCR unicellulaire. De plus, les transgènes insérés peuvent être réduits au silence de manière plutôt imprévisible. Des approches récentes utilisent la technologie CRISPR/CAS ou des systèmes d'intégrase dédiés qui sont indépendants des vecteurs viraux, mais à l'heure actuelle, la taille de la bibliothèque est limitée19,20,21. D'autres méthodes reposent sur une évolution dirigée continue, où un vecteur viral basse fidélité est utilisé, créant une mutagenèse permanente lors de la réplication virale. Bien que cela surmonte le défi de créer diverses bibliothèques virales recombinantes, de tels systèmes sont difficiles à contrôler et nécessitent des régimes de sélection efficaces22,23.

Ici, nous présentons un système de sélection de mammifères pour l'évolution dirigée des RCPG, qui est basé sur un vecteur Vaccinia. Il permet la génération facile de bibliothèques très diverses qui se traduisent par une expression homogène des GPCR, essentielle pour une sélection ultérieure guidée par l'expression. Nous utilisons ce système pour faire évoluer les GPCR de classe A et B et démontrer qu'en combinaison avec une conception de bibliothèque rationnelle, il peut être utilisé pour des manipulations étendues des propriétés GPCR, allant de la génération de variants de récepteurs hautement stabilisés à la modulation des propriétés de signalisation des récepteurs.

L'expression monoclonale et homogène du gène d'intérêt sont des conditions préalables essentielles pour les sélections en évolution dirigée qui sont difficiles à réaliser dans les cellules de mammifères avec des stratégies d'expression courantes telles que la transfection transitoire. Pour atteindre à la fois un dosage de gène et une clonalité égaux, la cellule doit prendre une seule molécule de vecteur et la répliquer en un nombre de copies similaire dans toutes les cellules. Ainsi, nous avons utilisé un système de vecteur que nous avions récemment conçu pour générer diverses bibliothèques d'ADNc dans le virus de la vaccine24,25. Le virus de la vaccine possède un génome d'ADN linéaire d'environ 180 kDa qui est répliqué et encapsidé dans le cytoplasme. Par conséquent, l'expression génique du vecteur est homogène entre les cellules, et des recombinants spécifiques peuvent être facilement récupérés même à partir de très petits nombres de cellules sélectionnées.

Pour tester si l'expression GPCR uniforme peut être obtenue avec le vecteur Vaccinia, nous avons évalué l'expression de plusieurs variantes du récepteur de la neurotensine 1 (NTR1). Les cellules A-431 ont été infectées avec le virus recombinant à une MOI de 1 pfu par cellule, assurant ainsi une distribution moyenne d'une particule virale par cellule. 16 à 18 h après l'infection, les cellules ont été récoltées et l'expression du récepteur a été analysée par cytométrie en flux à l'aide du ligand NT marqué par fluorescence (8–13) et comparée aux cellules CHO qui avaient été transfectées de manière transitoire avec les mêmes constructions de récepteurs. Les cellules infectées par la vaccine présentaient des niveaux d'expression homogènes avec une distribution étroite (Fig. 1a). Ainsi, une discrimination claire dans l'expression des récepteurs entre NTR1 de type sauvage et NTR1-TM86V et NTR1-L5X, deux variantes qui avaient été précédemment développées pour une expression fonctionnelle accrue dans E. coli26, était possible. En revanche, l'expression des variants du récepteur dans des cellules transfectées de manière transitoire a entraîné une large distribution des niveaux d'expression pour chaque construction, reflétant ainsi les quantités variables de plasmide absorbées par les cellules (Fig. 1a). Par conséquent, le système d'expression basé sur Vaccinia permet une expression homogène des GPCR dans les cellules de mammifères et permet une discrimination claire entre les variantes avec des niveaux d'expression distincts. Pour créer des bibliothèques d'ADNc vastes et diverses, nécessaires à l'évolution dirigée, une stratégie de recombinaison spécifique a été développée, que nous avons appelée recombinaison trimoléculaire24. Ici, un génome divisé de Vaccinia est complété par un troisième fragment portant le gène d'intérêt avec un marqueur de sélection. Ce n'est que lors de la recombinaison des trois fragments que des particules virales productives sont formées. En conséquence, le fond de virus non recombinant est proche de zéro, permettant la construction de bibliothèques contenant des millions de différents recombinants de Vaccinia24. Sur la base de ces résultats, nous avons conçu une plate-forme de sélection pour l'évolution dirigée des GPCR dans les cellules de mammifères qui s'inspire de l'évolution guidée par l'expression dans les cellules bactériennes et de levure5,8 (Fig. 1b).

a Comparaison de l'expression de GPCR dans des cellules de mammifères transfectées par plasmide et transduites par Vaccinia. Cellules CHO transfectées de manière transitoire (panneau supérieur droit), cellules A431 infectées par des constructions de virus de la vaccine (panneau inférieur droit). Le contrôle négatif (grisé), NTR1 (ligne noire), NTR1-TM86V (ligne rouge) et NTR1-L5X (ligne bleue) sont affichés. b Flux de travail pour l'évolution dirigée dans des cellules de mammifères à l'aide du virus de la vaccine. Après synthèse de la banque d'ADN GPCR, une banque de virus de la Vaccine est créée par Recombinaison Trimoléculaire24 (encadré gauche ; jaune, régions homologues au virus pour la recombinaison ; bleu, gène d'intérêt). A cette fin, la banque d'ADN GPCR randomisée est d'abord clonée dans un plasmide de transfert du virus de la vaccine. Le gène GPCR est ensuite recombiné avec l'ADN du virus de la vaccine digéré, et les particules virales infectieuses sont conditionnées à l'aide d'un virus auxiliaire de la variole aviaire. La bibliothèque de virus est utilisée pour infecter les cellules A-431 pendant la nuit à une multiplicité d'infection d'un virus par cellule, couvrant la diversité de la bibliothèque à une redondance de 5 à 10. Comme la membrane plasmique des cellules de mammifères est facilement accessible depuis l'espace extracellulaire (ECS), les récepteurs exprimés peuvent être directement marqués avec un ligand fluorescent de choix. Les cellules qui ont une densité de récepteurs plus élevée présenteront une liaison de ligand plus élevée et donc une fluorescence plus élevée, qui sont ensuite triées par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Après tri, les cellules sont lysées mécaniquement pour libérer le virus qui est ensuite amplifié sur des cellules nourricières fraîches. Le pool de virus trié peut ensuite être utilisé pour infecter pour les cycles de sélection ultérieurs.

Tout d'abord, nous avons cherché à comparer les capacités du système mammifère à des sélections d'approches d'évolution dirigée antérieures dans des cellules microbiennes. Nous avons donc choisi NTR1, car nos travaux précédents avaient étudié ce récepteur dans quatre systèmes de sélection microbienne différents, qui ont tous montré une sélection réussie pour une stabilité plus élevée et une expression fonctionnelle plus élevée des GPCR5,6,7,8. Au lieu de créer une bibliothèque entièrement aléatoire par PCR sujette aux erreurs, une approche semi-rationnelle a été adoptée pour générer une bibliothèque synthétique où la position et le type de mutation pourraient être facilement contrôlés. Sur la base de la structure cristalline NTR1 (PDB ID : 4BUO) 10, les résidus ont été choisis pour la randomisation qui étaient très probablement impliqués dans les contacts hélice-hélice, tandis que les résidus faisant face à l'environnement de la membrane lipidique ou potentiellement impliqués dans l'interaction ligand ou protéine G ont été exclus. Au total, 94 résidus ont été sélectionnés pour la randomisation. La mutagenèse était limitée à un ensemble prédéfini de substituants pour chaque position, qui avaient été dérivés d'une matrice de substitution phylogénétique comprenant les acides aminés les plus répandus pour chaque position des GPCR de classe A (Fig. 1 supplémentaire, cf. Notes supplémentaires). Pour rendre le résultat de sélection comparable aux campagnes précédentes menées dans des systèmes d'affichage microbiens, nous avons décidé de découpler le récepteur de ses protéines G apparentées ab initio, empêchant ainsi toute influence potentielle de l'interaction récepteur-protéine G, qui est possible dans les cellules de mammifères mais pas dans les cellules microbiennes, sur le résultat de la sélection. À cette fin, R1673.50 a été muté en Leu dans toute la bibliothèque, qui était par ailleurs basée sur le rNTR1 de type sauvage. L1673.50 perturbe le motif D/ERY conservé qui est nécessaire au couplage de la protéine G et donc à la fixation du récepteur dans un état inactif14,27,28,29 (Fig. 1 supplémentaire).

La bibliothèque d'ADNc résultante contenait en moyenne 2, 9% de mutations pour chaque position randomisée, ce qui entraînait en moyenne 2, 8 mutations par gène (Fig. 1d, e supplémentaires). À partir de cette bibliothèque synthétique, une bibliothèque virale a été créée par recombinaison trimoléculaire donnant une diversité de 1,3 × 108, et les cellules A-431 ont été infectées à un MOI de 1. Comme dans l'évolution précédente des récepteurs microbiens, les sélections ont été effectuées en fonction du niveau d'expression fonctionnelle. À cette fin, les cellules exprimant le récepteur ont été incubées avec des concentrations saturantes de NT (8–13) marqué par fluorescence et soumises à un FACS, les cellules présentant les niveaux de fluorescence les plus élevés (c'est-à-dire l'expression du récepteur la plus élevée) ont été enrichies. Après chaque cycle de tri, le virus a été directement isolé des pools de cellules enrichies, amplifié et utilisé pour infecter un nouveau lot de cellules pour le cycle de sélection suivant (Fig. 1b). Au total, deux cycles de sélection ont été effectués en bloquant les 0,5 % et 0,06 % supérieurs des cellules fluorescentes, respectivement. Après chaque cycle de sélection, un décalage vers la droite du signal de fluorescence de la population triée a été observé, indiquant un niveau d'expression du récepteur plus élevé dans le pool sélectionné (Fig. 2a). A partir de chaque pool de sélection, l'ADNc de NTR1 a été amplifié par PCR et sous-cloné dans un vecteur d'expression de mammifère et séquencé. 94 clones ont été isolés et criblés pour les niveaux d'expression des récepteurs, et les 25 clones les plus exprimant ont été analysés plus avant. Dans l'ensemble, les niveaux d'expression étaient entre 25 et 82 fois supérieurs à ceux de NTR1 de type sauvage et donc similaires ou même supérieurs aux niveaux atteints par les mutants développés par E. coli26. En revanche, le mutant sous-jacent NTR1-R167L n'a montré qu'un gain d'expression de 2, 5 fois par rapport au NTR1 de type sauvage, ce qui indique que la pression de sélection a réussi et que la majeure partie de l'augmentation de l'expression s'est accumulée lors des sélections (Fig. 2b, Tableau supplémentaire 1).

a Portes de tri pour les variantes NTR1 améliorées (panneau de gauche). La porte de tri pour les 0,5 % de cellules fluorescentes supérieures est indiquée par un contour rouge. Histogramme comparant les populations de premier et deuxième tri après amplification par rapport au type sauvage (panneau de droite) : tri 1 (ligne rouge), tri 2 (ligne bleue), NTR1 (ligne noire), contrôle négatif (ombré gris foncé). b Analyse de l'expression de 25 variants NTR1 évolués. L'expression du récepteur a été évaluée dans les cellules HEK293T par analyse de cytométrie en flux avec des concentrations saturantes de HL488-NT (8–13). Les niveaux d'expression sont relatifs à l'expression du récepteur de type sauvage et sont donnés sous forme de valeurs moyennes ± sem de 2 expériences indépendantes. c Affinités ligand de 25 variants NTR1 évolués. Les valeurs IC50 ont été dérivées d'expériences de liaison de compétition de ligands de cellules entières avec NT (8–13). Les barres représentent le changement moyen ± sem dans l'affinité calculée (∆pIC50) pour chaque mutant, par rapport au récepteur de type sauvage de 3 expériences indépendantes chacune réalisée en double technique (tableau supplémentaire 1). d Corrélation entre l'expression du récepteur et la thermostabilité. La thermostabilité de sept variants de NTR1 a été évaluée dans des fractions de membrane cellulaire et est tracée en tant que changement de température de fusion (∆Tm), mesuré par liaison de ligand, du récepteur de type sauvage par rapport aux niveaux d'expression de (b). Les données représentent les valeurs moyennes ± sem de 2 à 3 expériences indépendantes réalisées en double (tableau supplémentaire 1). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Comme pour le mutant R1673.50L, la signalisation de tous les variants NTR1 évolués, tous contenant cette mutation, était fortement altérée, n'atteignant que 35% de l'efficacité du NTR1 de type sauvage avec les meilleurs mutants (Fig. 2 supplémentaire, Tableau supplémentaire 1). Ainsi, la mutation commune R1673.50L a eu un fort impact sur la fonction des récepteurs qui n'a pas pu être surmonté par l'évolution. La mutation R1673.50L à elle seule a augmenté l'affinité pour NT (8–13) ~ 3 fois, tandis que les variants de récepteurs évolués présentaient une affinité agoniste jusqu'à 30 fois accrue (Fig. 2c, tableau supplémentaire 1). Cet écart apparent d'obtention d'une affinité plus élevée en l'absence de mutations directes dans le site de liaison orthostérique et en l'absence de couplage de la protéine G a été observé pour plusieurs autres variants de NTR1 évolués dans E. coli et certains mutants de récepteurs stabilisés par d'autres moyens également10,14,26,30. C'est probablement le résultat de la perturbation du couplage allostérique entre le site de liaison de l'agoniste et l'interface intracellulaire de la protéine G par la perturbation du micro-commutateur DRY et une stabilisation du récepteur dans une conformation inactive, malgré une liaison de haute affinité27,31. Cela a été corroboré lors de l'analyse de la thermostabilité de plusieurs clones. Les sept variantes testées étaient fortement stabilisées et leurs températures de fusion variaient de 4 à 10 ° C au-dessus de NTR1 de type sauvage, alors que la mutation R1673.50L seule n'avait aucun effet sur la thermostabilité (tableau supplémentaire 2). Comme dans les campagnes d'évolution précédentes réalisées chez E. coli 26 , une forte corrélation positive entre les niveaux d'expression et la thermostabilité a également été observée (Fig. 2d). L'analyse de séquence a révélé entre 5 et 8 mutations par variant. Trois points chauds de mutation, A1553.38T, Q2395.36T et N3657.49K, étaient présents respectivement dans 56%, 96% et 80% des clones, suggérant une forte pression de sélection sur chacun de ces résidus (Fig. 3 supplémentaire). A1553.38T et Q2395.36T ne sont pas conservés dans les GPCR de classe A et aucune corrélation claire avec une thermostabilité accrue ne peut être établie. Le N3657.49 hautement conservé fait partie du microcommutateur NPxxY et est couplé au site sodium allostérique constitué par D2.50 dans les GPCR de classe A, qui sont tous deux des médiateurs importants pour la propagation du signal. Il a été démontré que la mutation de D2.50 stabilise efficacement différents RCPG de classe A8,32, mais aucune mutation de ce type n'a été trouvée dans notre sélection. Ainsi, il sera intéressant de voir si la mutation N3657.49K a des effets structuraux et stabilisateurs similaires à ceux de la perturbation du site sodium.

Collectivement, ces données démontrent que dans les cellules de mammifères, des variants de récepteurs hautement stabilisés et exprimant bien peuvent être obtenus en seulement deux cycles de sélection qui sont comparables aux variants les plus exprimant qui ont été obtenus par évolution bactérienne. Semblables aux variants obtenus à partir de sélections bactériennes où le couplage aux protéines G n'est pas possible, les récepteurs évolués conservant la mutation R1673.50L étaient fortement altérés dans la signalisation des protéines G. Cela suggère que les récepteurs évolués ont été stabilisés principalement dans des conformations inactives, mais sont toujours capables d'obtenir une liaison agoniste de haute affinité, ce qui explique les propriétés biophysiques améliorées. Cependant, aucune similarité de séquence n'était apparente entre les variants NTR1 évolués dans les cellules de mammifères et les variants NTR1-TM86V et NTR1-L5X issus d'E. coli. Ainsi, des propriétés biophysiques similaires peuvent être obtenues par sélection de changements structurels distincts.

Les GPCR ont évolué pour détecter une pléthore de stimuli distincts de leur côté extracellulaire, ce qui se reflète dans une grande variabilité structurelle des régions réceptrices extracellulaires. Certains GPCR contiennent des domaines extracellulaires (ECD), qui présentent souvent des plis complexes qui nécessitent les mécanismes complexes de contrôle de la qualité de la cellule de mammifère pour un repliement et une translocation appropriés vers la surface cellulaire. Après avoir démontré qu'avec notre système, la stabilisation des récepteurs et l'optimisation de l'expression peuvent être obtenues dans des proportions similaires ou supérieures aux résultats des systèmes microbiens, nous nous sommes demandé si des récepteurs avec des architectures plus complexes seraient également susceptibles d'être sélectionnés dans le système mammifère. Pour répondre à cette question, nous avons choisi le récepteur de l'hormone parathyroïdienne 1 (PTH1R) qui appartient à la classe B des RCPG.

Les récepteurs de cette classe diffèrent structurellement des GPCR de classe A par un grand domaine extracellulaire supplémentaire qui est requis pour la liaison des ligands peptidiques. De plus, plusieurs modifications post-traductionnelles de l'ECD ajoutent une complexité structurelle significative au récepteur fold11,33,34,35, ce qui entrave l'expression dans les microbes. Auparavant, nous avons réussi à faire évoluer le TMD de PTH1R dans la levure pour une expression et une stabilité plus élevées avec un petit ligand peptidique modifié, ce qui était une condition préalable à la résolution de la structure cristalline du récepteur de pleine longueur11. Pourtant, les tentatives de faire évoluer directement le PTH1R pleine longueur en utilisant le ligand peptidique natif 34 aa avaient échoué, en raison de l'accumulation toxique de récepteur mal replié et en raison de la grande taille du ligand, incapable d'atteindre le site de liaison du ligand dans les cellules de levure malgré la perméabilisation de la paroi cellulaire, démontrant les limites des systèmes de sélection microbienne.

Pour effectuer l'évolution de PTH1R dans le système mammifère, une bibliothèque synthétique a été créée, suivant une approche semi-rationnelle similaire à la bibliothèque pour NTR1 décrite ci-dessus. La randomisation a été limitée au PTH1R TMD, évitant ainsi les modifications de l'ECD qui pourraient potentiellement affecter la liaison du ligand. Comme ce travail avait été réalisé avant la détermination de la structure PTH1R11, la conception de la bibliothèque était basée sur un modèle d'homologie structurale du récepteur humain du glucagon. Ainsi, 118 positions dans le TMD ont été sélectionnées pour la randomisation, et ici les substituants d'acides aminés ont été choisis en fonction de la similarité chimique. Cependant, contrairement à la bibliothèque NTR1, aucune mutation fixe susceptible de perturber la fonction du récepteur n'a été introduite, car nous étions intéressés à déterminer si les propriétés du récepteur au-delà de l'expression et de la stabilité pouvaient également évoluer dans les cellules de mammifères (Fig. 4 supplémentaire, cf. Notes supplémentaires). Néanmoins, plusieurs modifications ont été apportées à la bibliothèque pour pouvoir tracer les résultats de la sélection. Nous avons inclus 19 positions qui avaient été identifiées dans la campagne d'évolution de la levure, dont 7 mutations spécifiques maintenaient le récepteur dans une conformation inactive et hautement thermostable11. Contrairement à la mutation R1673.50L fixe dans la bibliothèque NTR1, chacune des positions dérivées de la levure était entièrement randomisée, permettant ainsi la sélection des résidus de type sauvage ou alternatifs à une telle position au cours de l'évolution. De plus, C351, qui forme une liaison disulfure entre l'ECL (boucle extracellulaire) 2 et le sommet de l'hélice transmembranaire 311, a été randomisé pour tester si la perturbation des résidus structurellement pertinents corromprait les sélections (Fig. 4C supplémentaire).

La bibliothèque d'ADNc résultante contenait en moyenne 5, 6% de mutations pour chaque position randomisée, entraînant environ 7 mutations par gène (Fig. 4E – F supplémentaire). À partir de cette bibliothèque synthétique, une bibliothèque virale a été générée, produisant une diversité de 1,1 × 108, et des cellules A-431 ont été infectées avec la bibliothèque à un MOI de 1. Pour les sélections suivantes, deux ligands peptidiques marqués par fluorescence ont été utilisés : premièrement, le court peptide M-PTH (1-14) qui avait été conçu pour se lier uniquement au TMD de PTH1R, tout en conservant la pleine puissance agoniste du peptide natif36, et deuxièmement, l'analogue de PTH P TH'(1–34) qui ressemble à l'agoniste peptidique natif, car il nécessite des interactions avec l'ECD et le TMD du récepteur pour une liaison de haute affinité11,37,38. Au total, trois cycles de sélection avec chacun des ligands marqués par fluorescence ont été effectués, triant les 0, 2 à 0, 5% de cellules fluorescentes supérieures (Fig. 4G supplémentaire). Ici également, une fluorescence cellulaire plus élevée a été observée avec l'augmentation des cycles de sélection, bien que seule une petite population de cellules hautement fluorescentes ait pu être maintenue (Fig. 3a). Après le dernier cycle, 92 clones de chaque sélection de ligand ont été criblés pour l'expression, et les 43 variants exprimant le haut des deux pools ont été analysés plus avant. Comme pour les variants NTR1 évolués, une augmentation de l'expression a été observée pour tous les variants PTH1R, bien que dans des proportions moindres (jusqu'à 9 fois pour PTH1R contre jusqu'à 85 fois pour NTR1) par rapport au type sauvage (Fig. 3b, Tableau supplémentaire 3). Cependant, toutes les variantes de PTH1R sont restées actives dans la signalisation, avec environ 50 % des variantes dépassant les niveaux maximaux d'AMPc atteints par l'activation de PTH1R de type sauvage (Fig. 3c, Tableau supplémentaire 4). Cela contraste avec l'évolution précédente de PTH1R dans la levure, où des variants hautement stables mais inactifs de signalisation ont été obtenus11. L'analyse de la séquence des variants PTH1R évolués a révélé un ensemble assez diversifié de mutations (Fig. 5 supplémentaire). Contrairement à NTR1, aucune mutation hautement conservée n'a été trouvée et aucun motif conservé de GPCR de classe B n'a été modifié. Pourtant, L3685.44, interagissant avec le Val2PTH/PTHrP conservé et M4256.57 et T4276.59 qui interagissent avec le résidu N-terminal des peptides PTH dans PTH1R38,39,40 à l'état actif, s'est avéré muté dans plus de 25 % des variants sélectionnés. Ainsi, ces mutations pourraient fournir une justification mécaniste de l'augmentation observée de la puissance des récepteurs et nécessiter des analyses supplémentaires.

a Comparaison des populations après sélection avec PTH'(1–34)-HL647 (panneau de gauche) ou M-PTH(1–14)-HL647 (panneau de droite) à PTH1R de type sauvage : tri 1 (ligne rouge), tri 2 (ligne bleue), tri 3a (ligne noire), tri 3b (ligne verte, répétition de 3a), contrôle négatif (grisé foncé). b Analyse de l'expression de 43 variants PTH1R évolués évalués dans des cellules HEK293T vivantes par analyse de cytométrie en flux avec des concentrations saturantes de PTH'(1–34)-HL647. Les niveaux d'expression sont relatifs à l'expression du récepteur de type sauvage et sont donnés sous forme de valeurs moyennes ± sem de 2 à 3 expériences indépendantes (tableau supplémentaire 3). c Accumulation d'AMPc de 43 variants évolués de PTH1R après stimulation avec 1 µM de PTH (1–34). Les données représentent les concentrations maximales d'AMPc par rapport à PTH1R. Les barres représentent les valeurs moyennes ± sem de 3 à 6 expériences indépendantes réalisées en double (tableau supplémentaire 4). d Affinités des ligands de 43 variants PTH1R évolués par rapport à PTH1R. Les valeurs IC50 ont été dérivées d'expériences de liaison compétitive de ligands de cellules entières avec M-PTH (1–14) ou PTH (1–34). Les barres représentent le changement moyen ± sem de l'affinité calculée (∆pIC50) pour chaque mutant par rapport au récepteur de type sauvage de 2 à 8 expériences indépendantes réalisées en double (tableau supplémentaire 3). b–d Les ligands utilisés pour la sélection sont indiqués sous les diagrammes à barres. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Comme nous avions autorisé les mêmes mutations dans la bibliothèque actuelle que dans la bibliothèque de levures, il était intéressant d'observer que les mutations qui contribuaient à la stabilisation du récepteur mais en même temps perturbaient la signalisation du récepteur étaient désélectionnées dans le système mammifère et que dans presque toutes les positions, la variante de type sauvage était préférée (Fig. 6 supplémentaire). Ainsi, les mutations qui avaient été critiques pour le succès de la stabilisation d'une conformation de récepteur inactif dans les cellules de levure n'étaient pas préférées dans un environnement compétent de signalisation. De même, les mutations de C351 ont été complètement rejetées, indiquant que la formation du disulfure entre ECL 2 et l'hélice 3 est un trait important lors de la sélection (Fig. 6 supplémentaire), ce qui est conforme à sa pertinence connue dans la fonction du récepteur33. En outre, en ce qui concerne l'affinité du ligand, des différences distinctes avec les variantes NTR1 précédemment développées ont été observées. L'affinité de liaison de la PTH (1–34) était pour la plupart inchangée ou seulement légèrement augmentée (0, 6 à 5 fois) pour les variantes PTH1R. Cependant, la plupart des variants de récepteurs présentaient une affinité fortement accrue pour la M-PTH (1–14), indiquant une différence fondamentale dans la liaison des deux ligands, où la PTH (1–34) peut compter sur sa liaison à l'ECD (Fig. 3d, Tableau supplémentaire 3). Cependant, ces différences ne semblaient pas être induites par le type de ligand lors de la sélection car aucune différence en ce qui concerne les propriétés apparentes des récepteurs entre les variants de l'un ou l'autre des régimes de sélection n'a été détectée. Pris ensemble, dans les cellules de mammifères, il était possible de faire évoluer le PTH1R complet avec un ensemble de deux ligands de tailles différentes, ce qui n'avait pas été possible dans les systèmes microbiens en raison des limitations imposées par l'hôte d'expression. De plus, des variants de récepteurs ont été obtenus qui sont restés compétents en matière de signalisation, démontrant l'importance du contexte cellulaire pour le résultat de la sélection.

Pour NTR1, le découplage de la transmission allostérique de la poche de liaison à l'interface de la protéine G permet probablement l'accumulation d'une affinité agoniste accrue, dirigeant ainsi le récepteur dans une conformation de liaison à l'agoniste, inactive mais stable. Ce n'était pas le cas pour le PTH1R évolué. Lorsque nous avons évalué la thermostabilité de cinq variants de récepteurs évolués dans des fractions membranaires isolées, tous les variants testés présentaient une thermostabilité réduite par rapport au PTH1R de type sauvage (Fig. 7A supplémentaire, Tableau supplémentaire 5). Compte tenu de la capacité de signalisation conservée en combinaison avec une affinité accrue pour le ligand des variants PTH1R évolués et du fait que l'évolution dirigée a été réalisée dans des cellules de mammifères exprimant des protéines G, nous avons émis l'hypothèse que les mutations sélectionnées pourraient avoir optimisé le récepteur pour ce contexte. Conformément à cette idée, en présence de mini-G, la thermostabilité a augmenté pour la plupart des mutants (Fig. 7B supplémentaire) et pour P34_05, la diminution a été diminuée, donnant une amélioration relative pour tous les mutants (Fig. 7C supplémentaire). Cela est devenu encore plus évident lorsque nous avons comparé la liaison de différents ligands dans des cellules entières. Comme indiqué ci-dessus, les affinités des deux agonistes, M-PTH (1–14) et PTH (1–34), ont été augmentées pour les variants PTH1R par rapport au PTH1R de type sauvage (Figs. 3d, 4a). Cependant, pour l'agoniste partiel PTH (3–34), et plus prononcé pour l'agoniste inverse IA-PTH (7–34), une inversion des affinités relatives a été observée, où le PTH1R de type sauvage avait une affinité apparente légèrement supérieure à celle des variants évolués (Fig. 4a). Selon le modèle complexe ternaire de la signalisation GPCR, l'association de la protéine G déplace l'équilibre conformationnel du récepteur vers un état actif, ce qui augmente de manière allostérique l'affinité agoniste et diminue à son tour l'affinité antagoniste41,42,43. Nous avons donc émis l'hypothèse que les variants PTH1R évolués pourraient avoir incorporé des mutations qui stabilisent une conformation favorisant la liaison aux protéines G, déplaçant ainsi l'équilibre du récepteur vers un état de haute affinité pour les agonistes en présence de protéines G.

a Les variants évolués de PTH1R présentent une liaison agoniste de haute affinité mais une affinité égale ou réduite pour les agonistes partiels ou inverses dans les cellules. Courbes de liaison compétitive des ligands complets [M-PTH(1–14) et PTH(1–34)], partiels [PTH(3–34)] et agonistes inverses [IA-PTH(7–34)], mesurés dans des cellules entières exprimant le PTH1R de type sauvage ou 5 variants évolués. b L'affinité agoniste élevée des variants évolués de PTH1R est similaire à celle du PTH1R de type sauvage à l'état lié à la protéine G. Les courbes de liaison des ligands de M-PTH (1–14) aux PTH1R évolués ont été mesurées dans des fractions membranaires, obtenues à partir de cellules exprimant le PTH1R de type sauvage ou 5 variants évolués, en l'absence (panneau de gauche) ou en présence (panneau du milieu) de 12, 5 µM mini-Gs. Constantes de liaison relatives obtenues par compétition de la liaison de la M-PTH(1–14) avec la M-PTH(1–14) marquée, mesurées dans les cellules entières (de a) par rapport aux fractions membranaires en l'absence ou en présence de 12,5 µM de mini-G (panneau de droite). Les valeurs positives reflètent donc une liaison plus forte sur les fractions membranaires que sur les cellules. c L'affinité agoniste accrue dépend de la protéine G. La liaison de 40 nM de M-PTH(1–14) a été mesurée dans des fractions membranaires additionnées de concentrations croissantes de mini-Gs. Les données sont relatives aux niveaux de liaison de PTH1R en l'absence de mini-G (zone grise). Panneau de gauche : variantes montrant une augmentation basale et dépendante de la protéine G accrue de la liaison du ligand. Les valeurs EC50 sont indiquées sous forme de lignes verticales pointillées (PTH1R : 1,39 ± 0,2 µM, P34_05 : 0,28 ± 0,06 µM, P34_13 : 0,38 ± 0,1 µM). Panneau de droite : variantes montrant une augmentation de la liaison du ligand indépendamment de la protéine G. L'augmentation indépendante de la protéine d G de la liaison du ligand est due à une activité basale plus élevée. Les niveaux d'AMPc ont été mesurés 30 min après l'ajout de l'inhibiteur de la phosphodiestérase IBMX aux cellules exprimant des variants de PTH1R et ont été normalisés aux niveaux d'expression des récepteurs. Les données représentent les valeurs moyennes ± sem de 3 expériences réalisées en double. **p = 0,0044, ****p < 0,0001. La signification statistique a été déterminée par ANOVA unidirectionnelle et multi-comparaison de Bonferroni. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Pour tester cette hypothèse, nous avons directement comparé l'effet de la protéine G sur la liaison du ligand. L'affinité de la M-PTH (1–14) pour le PTH1R de type sauvage dans les fractions membranaires isolées a été multipliée par 5 par rapport à son affinité dans les cellules entières, ce qui reflète probablement la formation d'un complexe récepteur-protéine G plus stable en raison de concentrations plus faibles de nucléotides dans les fractions membranaires42. En revanche, les affinités agonistes des variants évolués sont restées identiques à leurs affinités dans les cellules entières. Uniquement pour le variant P34_13, une diminution de l'affinité au niveau du PTH1R sauvage en passant des cellules aux membranes a été observée. En ajoutant des mini-G aux fractions membranaires, ce qui imite l'état activé de la protéine G44, l'affinité PTH1R de type sauvage a encore été déplacée vers celle des variants évolués, ce qui suggère qu'en effet l'état de haute affinité des variants évolués était dû à une propension plus élevée à adopter une conformation à l'état actif (Fig. 4b).

Pour corroborer ces résultats, nous avons en outre évalué l'influence de la protéine G pour induire un état de haute affinité pour chacune des variantes. À cette fin, l'occupation des récepteurs par la M-PTH (1–14) à des concentrations sous-maximales a été mesurée en fonction de l'augmentation des concentrations de protéines G (Fig. 4c). Pour toutes les variantes de récepteurs évoluées déjà en l'absence de protéine G ajoutée de manière externe, une plus grande fraction du récepteur était liée au ligand par rapport au PTH1R de type sauvage, reflétant l'état apparent de haute affinité observé dans les courbes de liaison compétitives. Comme prévu, avec l'augmentation de la concentration en protéines G, la liaison fractionnée de M-PTH (1–14) au PTH1R de type sauvage a été décalée jusqu'à 2 fois, indiquant la transition du récepteur vers un état de haute affinité induit par la liaison aux protéines G. Les variantes P34_05 et P34_13 avaient un comportement similaire, car les deux variantes étaient passées à un état de haute affinité avec des concentrations croissantes de protéines G ajoutées. Cependant, des valeurs EC50 4 à 5 fois plus faibles suggèrent que les deux variants de récepteurs présentent une affinité plus élevée pour la protéine G, atteignant ainsi plus facilement l'état de haute affinité. En revanche, les variantes P34_06, P34_07 et P14_12 étaient déjà dans un état de haute affinité, qui était indépendant de la protéine G ajoutée. De même, ces dernières variantes présentaient une activité de récepteur basale accrue, tandis que l'activité basale des variantes P34_05 et P34_13 était similaire à celle du PTH1R de type sauvage (Fig. 4d). Par conséquent, l'évolution de PTH1R avec un agoniste dans un environnement compétent pour la signalisation a conduit à l'accumulation de mutations qui favorisent la transition du récepteur vers un état actif lié à la protéine G ou qui favorisent la signalisation du récepteur basal dans une conformation compatible avec la liaison de l'agoniste, qui se traduisent toutes deux par une affinité apparente plus élevée pour les agonistes.

Des systèmes de sélection de bactéries et de levures ont été utilisés pour l'évolution dirigée des GPCR puisque de grandes bibliothèques peuvent être créées, où chaque cellule porte une seule variante de récepteur. L'efficacité élevée de la transformation et l'établissement d'un nombre de copies de plasmide plutôt uniforme garantissent que la liaison entre le génotype et le phénotype est préservée et que les deux peuvent être facilement déterminés. Cependant, l'applicabilité des systèmes microbiens est limitée à des ligands relativement petits qui peuvent être utilisés pour la sélection en raison de la barrière externe d'une paroi cellulaire ou d'une membrane externe. De plus, étant donné qu'une expression minimale du récepteur natif au début du processus de sélection est requise, la toxicité de certains récepteurs peut être un problème.

Ici, nous démontrons le développement d'un système qui n'a pas de telles limitations. Les cellules de mammifères offrent un environnement cellulaire natif pour les GPCR, y compris le contrôle de la qualité lors de l'exportation, la composition de la membrane et la machinerie de modification post-traductionnelle, résultant en des conditions d'expression optimales même pour les récepteurs complexes. Dans le même temps, la poche de liaison du ligand est facilement accessible à la surface cellulaire pour les ligands de toute taille et composition. Même des modulateurs spécifiques à la conformation se liant à la surface extracellulaire tels que des fragments d'anticorps pourraient être utilisés comme outils de sélection. De plus, dans les cellules de mammifères, les GPCR sont intégrés dans le cadre de signalisation cellulaire endogène. Cela offre la possibilité même d'interroger les voies de signalisation et ainsi d'orienter la sélection vers des propriétés de signalisation spécifiques.

Cependant, la création de bibliothèques clonales dans des cellules de mammifères est difficile. Les méthodes de transfection standard ne conviennent pas car elles sont relativement inefficaces et généralement plusieurs centaines de plasmides - avec une propagation considérable d'une cellule à l'autre - sont absorbés par chaque cellule, empêchant le couplage du génotype et du phénotype par tous les moyens. La clé de notre développement était de tirer parti d'un système de transduction virale très efficace basé sur un vecteur Vaccinia24. Il combine la possibilité d'ajuster le taux de transduction à une moyenne d'une particule par cellule, maintenant ainsi la monoclonalité, couplée à une amplification vectorielle inhérente atteignant des nombres de copies plutôt uniformes. Une autre caractéristique est un module de recombinaison unique dans le vecteur viral qui permet la création de bibliothèques très diverses qui sont également compatibles pour les grandes protéines telles que les GPCR.

Alors que la mutagenèse aléatoire est couramment utilisée pour générer de la diversité génétique, nous avons plutôt créé des bibliothèques GPCR synthétiques par synthèse en phase solide à base de codons45,46, ce qui donne un contrôle total sur la position et la composition de la randomisation, tout en évitant les décalages de cadre et les codons d'arrêt. Ainsi, des connaissances structurelles et fonctionnelles antérieures peuvent être incorporées dans la conception pour améliorer les résultats de la sélection, exclure a priori les événements de sélection indésirables et introduire un biais prédéfini dans la bibliothèque, par exemple, pour les types d'acides aminés ou un pourcentage de codons de type sauvage. De plus, nous avons utilisé ici cette approche pour tester la fidélité du système de sélection en dopant les bibliothèques avec des mutations spécifiques avec des effets prévisibles. Pour NTR1, la structure cristalline10 a servi de modèle pour identifier les résidus appropriés pour la randomisation, et nous avons limité la mutagenèse aux acides aminés correspondants les plus courants de tous les GPCR de classe A, maintenant ainsi un contexte évolutif et excluant les mutations potentiellement préjudiciables. Pour PTH1R, nous avons conçu la bibliothèque sur la base d'un modèle d'homologie structurelle et d'une mutagenèse chimiquement conservatrice, car aucune information structurelle ni données phylogénétiques suffisantes n'étaient disponibles pour PTH1R à l'époque. Cela démontre que même en l'absence d'informations structurelles précises, des bibliothèques puissantes peuvent être générées. À l'avenir, des conceptions de bibliothèques encore plus sophistiquées pourraient être dérivées de la quantité sans cesse croissante d'informations structurelles et fonctionnelles sur les GPCR qui peuvent être facilement incorporées dans le flux de travail.

Notre premier objectif était de récapituler les sélections microbiennes, c'est-à-dire l'évolution des récepteurs en l'absence d'effecteurs en aval tels que les protéines G, afin de comparer la fidélité de ce système mammifère aux approches précédentes. Par conséquent, la bibliothèque de NTR1 a été conçue pour contenir la mutation R1673.50L, qui perturbe le motif DRY dans le noyau du récepteur, nécessaire au couplage de la protéine G14,27,28,29. Notamment, alors que la mutation R1673.50L en elle-même n'avait aucun effet sur la stabilité et seulement un effet modeste sur les niveaux d'expression par rapport à NTR1 de type sauvage, elle a permis le découplage du récepteur de la protéine G, ce qui a conduit à l'accumulation de mutations lors de la sélection qui ont simultanément et fortement augmenté les niveaux d'expression et la thermostabilité (Fig. 5). Plusieurs variantes ont même dépassé les niveaux d'expression des récepteurs qui avaient subi une évolution extensive guidée par l'expression chez E. coli26. De plus, conformément aux sélections précédentes dans les systèmes microbiens, toutes les variantes évoluées présentaient une affinité agoniste accrue, malgré leur incapacité à activer les protéines G. Il est important de noter que ce fait n'a pas empêché la sélection des caractéristiques souhaitées, une expression fonctionnelle plus élevée et une stabilité des protéines. Comme observé dans les structures de récepteurs précédemment stabilisés, cela peut suggérer que le découplage de la voie de transmission du signal a eu deux conséquences sur le résultat de la sélection : premièrement, les mutations ont été enrichies, ce qui a rigidifié la partie extracellulaire du récepteur proportionnellement à la liaison de l'agoniste, avec pour conséquence de favoriser la liaison de l'agoniste de haute affinité, contribuant ainsi à nouveau à la stabilité du récepteur. Deuxièmement, la partie intracellulaire du récepteur a été stabilisée par des mutations maintenant le récepteur dans une conformation inactive, favorisée par la présence de R1673.50L (Fig. 5). En bref, les deux parties du récepteur peuvent être considérées comme ayant évolué indépendamment.

Les GPCR échantillonnent une multitude d'états conformationnels qui sont modulés de manière allostérique par la liaison du ligand et de la protéine G. L'introduction d'une mutation découplante (étoile rouge) entraîne une perturbation de la transmission du signal de la poche de liaison du ligand à l'interface de la protéine G (chemin de gauche). Ainsi, dans l'évolution dirigée ultérieure en l'absence de protéine G ou lorsque sa liaison a été empêchée par une mutation stabilisant déjà l'état inactif, préférentiellement des mutations qui stabilisent davantage le récepteur dans un état inactif (gris) ont été sélectionnées, conduisant à une conformation rigide et stable. Si la fonction du récepteur est conservée au début de la sélection, l'environnement cellulaire, qui contient des protéines G, dicte le résultat de la sélection. Des mutations favorisant le couplage allostérique entre la conformation occupée par l'agoniste de la poche de liaison du ligand et la conformation à l'état actif (AS) de l'interface de liaison de la protéine G (bleu) ont été sélectionnées. Dans certains cas, des mutations ont été enrichies qui favorisent un fort couplage allostérique de la conformation à l'état actif, entraînant une activité constitutive du récepteur (vert). Figure modifiée d'après Nygaard et al.60.

En revanche, la bibliothèque PTH1R ne contenait aucune mutation fixe susceptible d'interférer avec la signalisation en aval. En conséquence, les protéines G endogènes étaient en principe capables d'interagir avec le récepteur et d'influencer le résultat de la sélection. En effet, les mutations qui avaient été délibérément incluses dans la banque et qui stabiliseraient le récepteur au prix d'une capacité de signalisation réduite n'ont pas été trouvées dans ces conditions de sélection. Conformément à cette découverte, des variants de récepteurs sélectionnés présentaient une thermostabilité encore plus faible par rapport au PTH1R de type sauvage dans des préparations membranaires dépourvues de protéines G, ce qui suggère qu'une voie de sélection fondamentalement différente avait été suivie. La stabilité accrue attendue a été observée dès que la protéine G a été ajoutée aux membranes.

Comme pour NTR1, une augmentation générale de l'expression du récepteur et de l'affinité du ligand a été observée pour la plupart des variants, indépendamment de l'agoniste peptidique qui avait été utilisé pour la sélection. Le gain d'affinité pour le ligand était plus prononcé pour la M-PTH(1–14) que pour la PTH native(1–34). Considérant que les mutations étaient limitées au TMD et que la M-PTH (1–14) n'établit aucun contact supplémentaire avec l'ECD, il était raisonnable de supposer que les changements au sein du TMD représentaient une affinité accrue pour le ligand. Les différences moins prononcées d'affinité pour la PTH(1–34) peuvent s'expliquer par l'énergie supplémentaire fournie par les interactions de la partie C-terminale de la liaison du peptide avec l'ECD dans les GPCR de classe B47.

Fait intéressant, l'augmentation apparente de l'affinité agoniste pour les variants PTH1R évolués était la plus importante dans les cellules entières. La liaison de l'agoniste à un GPCR déplace son équilibre conformationnel vers un état qui favorise l'interaction avec les protéines G48,49 et conduit ainsi à l'activation de la protéine G par déstabilisation de la poche de liaison aux nucléotides et dissociation du GDP50. Le complexe ternaire sans nucléotide résultant présente souvent une affinité de liaison agoniste accrue41, mais sa durée de vie est extrêmement courte in vivo en raison des concentrations élevées de GTP intracellulaire, ce qui entraîne une liaison rapide du GTP à Gα51. Dans les fractions membranaires, qui sont appauvries en nucléotides par rapport aux cellules entières, une augmentation relative de l'affinité agoniste du PTHR de type sauvage a été observée, reflétant la plus grande stabilité des complexes ternaires en l'absence de nucléotides. Cela était encore plus prononcé lors de la supplémentation des fractions membranaires avec des mini-G, imitant l'état sans nucléotide de Gα. Dans ces conditions, le récepteur de type sauvage présentait une affinité agoniste comparable à celle des variants évolués.

Ainsi, lors des sélections de PTH1R, des mutations ont été acquises qui permettent au récepteur de passer à un état de haute affinité même sans l'aide d'une conformation de protéine G à l'état actif. Par conséquent, le couplage allostérique du site de liaison du ligand avec la conformation active mais non inactive du site de liaison de la protéine G est renforcé par les mutations sélectionnées, entraînant simultanément une affinité plus élevée pour l'agoniste et la protéine G chez de nombreux mutants sélectionnés31 (Fig. 5). Conformément à cette découverte, l'affinité apparente pour les mini-G a été augmentée pour deux des variantes évoluées. Notamment, pour trois variantes, nous n'avons pu observer aucune influence supplémentaire des mini-G sur l'occupation agoniste du récepteur. Curieusement, ces trois variantes ont montré une activité de récepteur constitutive accrue, ce qui explique pourquoi l'état de haute affinité du récepteur n'est pas davantage modifié par l'ajout de protéine G.

Dans la présente étude, nous avons utilisé la liaison de ligand comme substitut pour l'expression d'un récepteur correctement replié et intégré et comme pression de sélection primaire. Bien que cela ait donné des variants de récepteurs optimisés pour l'expression et la stabilité pour NTR1, ce n'était pas le cas pour PTH1R lorsqu'il était mesuré comme pour NTR1. PTH1R a été autorisé à évoluer dans un environnement de signalisation entièrement fonctionnel, et nous avons observé que la sélection était fortement influencée par la fonction du récepteur. Même sans appliquer une pression de sélection directe sur la liaison aux protéines G, nous avons obtenu des variants de récepteurs qui atteignaient une stabilité plus élevée, mais uniquement lorsqu'ils étaient autorisés à engager une protéine G. Pourtant, contrairement aux sélections NTR1, lors des sélections PTH1R, il était plus difficile de maintenir le pool de cellules avec des niveaux de fluorescence élevés. Nous ne pouvons pas exclure que sous le stress de la sélection FACS avec un vecteur viral à haut nombre de copies, certains clones à haute expression soient perdus, tandis que d'autres sont compatibles. De plus, des variants présentant une activité constitutive élevée peuvent avoir été perdus au cours de la sélection en raison d'une internalisation constante rendant le récepteur inaccessible pour le ligand fluorescent et pouvant également altérer la viabilité cellulaire en raison d'une signalisation basale élevée.

Pris ensemble, ce système de sélection de mammifères nous a permis de sélectionner des récepteurs présentant des propriétés fonctionnelles fortement altérées qui seront des outils précieux pour étudier les mécanismes de transmission du signal dans cette classe de récepteurs. Les récepteurs stabilisés peuvent être utiles dans la découverte de médicaments à base de fragments, où les faibles puissances initiales empêchent les essais fonctionnels, et la recherche de résultats doit s'appuyer sur des essais de liaison, par exemple par RMN et SPR16 sur des récepteurs solubilisés. Les mutants à activité constitutive élevée peuvent être des candidats particulièrement intéressants pour les approches de criblage de médicaments52. Comme indiqué ci-dessus, certains de ces mutants pourraient être manqués avec la configuration actuelle, mais une solution pourrait être d'utiliser d'autres paramètres de sélection qui mesurent directement la signalisation en aval. Ces dernières années, une multitude de systèmes de capteurs sont devenus disponibles pour étudier la fonction GPCR à tous les niveaux de la cascade de signalisation dans les cellules de mammifères. Beaucoup de ces tests sont basés sur la fluorescence et sont en principe compatibles avec les applications de cytométrie en flux. De tels tests comprennent les tests d'interaction récepteur-protéine G, récepteur-arrestine ou même protéine G qui sont basés sur des systèmes de fluorophores fractionnés ou des capteurs FRET53,54,55,56,57. L'intégration de tels capteurs pour la sélection des récepteurs augmentera encore la polyvalence de notre système d'évolution des mammifères, car l'évolution des récepteurs peut être dirigée vers des propriétés fonctionnelles spécifiques. Cette stratégie devrait s'avérer particulièrement utile pour déchiffrer les mécanismes de biais de signalisation et les mécanismes de régulation de la transduction du signal médiée par GPCR. De plus, il permet la réutilisation des récepteurs membranaires en tant que biocapteurs pour des applications de dépistage de médicaments et pourrait être utilisé pour créer des outils pour des applications optogénétiques.

La PTH humaine (1–34) et la PTH (3–34) provenaient de Bachem. La neurotensine 8–13 [NT(8–13)] provenait d'Anaspec. La [Ac5c1, Aib3, Q10, Har11, A12, W14]PTH(1–14), [M-PTH(1–14)], a été synthétisée par Peptide Specialty Laboratories. La M-PTH(1–14) a été marquée à K13 avec le colorant HiLyte 647 [M-PTH(1–14)-HL647]. La [Nle8,18,Y34,C35]PTH(1–34) a été marquée en C35 avec le colorant HiLyte 647 [PTH'(1–34)-HL647, le prime indiquant les changements de séquence par rapport à PTH(1–34)]. La neurotensine 8–13 a été marquée par fluorescence avec HiLyte-647 [HL647-NT(8–13)] ou HiLyte-488 [HL488-NT(8–13)] au niveau du groupe amino N-terminal. Tous les peptides marqués par fluorescence ont été synthétisés sur mesure par Anaspec.

Les cellules HEK293T (n° cat. CRL-11268), A-431 (n° cat. CRL-1555) et les cellules BS-C-1 (n° cat. CCL-26) provenaient de l'ATCC et ont été cultivées dans du milieu modifié de Dulbecco additionné de 10 % (v/v) de sérum de veau fœtal. Les cellules ont été maintenues à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2, 95 % d'air. La transfection transitoire des cellules HEK293T a été réalisée avec le réactif TransIT-293 (Mirus) selon le protocole du fabricant. Des cellules CHO-S (Life Technologies, Cat. No. R80007) ont été maintenues sous forme de culture en suspension agitée en utilisant du milieu Power CHO 2CD (Lonza) additionné de 8 mM de L-glutamine, 0,1 mM d'hypoxanthine et 0,1 mM de thymidine. Les cellules ont été ensemencées dans du DMEM avec 10 % de sérum de veau fœtal pendant une nuit pour faciliter l'adhésion avant la transfection. La transfection transitoire a été réalisée avec le réactif Lipofectamine (Invitrogen) selon le protocole du fabricant.

Les bibliothèques d'ADNc pour la NTR1 de rat et la PTH1R humaine ont été synthétisées sur mesure par MorphoSys AG sous forme de fragments d'ADN linéaires à l'aide de la technologie Slonomics®26,45,46. Des parties constantes de la séquence ont été amplifiées à partir d'un plasmide contenant le type sauvage. Pour générer les parties variables, des mélanges de molécules d'ancrage ont été générés dans un rapport défini pour représenter toutes les combinaisons de deux positions adjacentes dans une région variable26,45,46. Ces mélanges ont été reliés à la chaîne d'ADN en croissance par ligation. Le produit de réaction a été purifié par immobilisation sur une surface revêtue de streptavidine (Microcoat). De nouveaux surplombs pour le cycle de réaction suivant ont ensuite été générés par restriction avec l'enzyme Eam1104I (Thermo Scientific), et un nouveau mélange de molécules d'ancrage a été ajouté. Après trois à sept cycles de réaction, des paires de produits ont été combinées pour générer des intermédiaires de transposition. Ceux-ci ont été soit combinés dans un second tour pour former de longues régions variables, soit assemblés avec des parties constantes par restriction et ligature. Les variantes de longueur ont été synthétisées séparément, quantifiées par PAGE, mélangées dans un rapport défini et assemblées en un seul pool. La bibliothèque PTH1R a été synthétisée séparément en deux fragments de taille égale et combinée par restriction avec Esp3I (Thermo Scientific) dans la région flanquante et ligature ultérieure. Le produit de ligature final a été amplifié à ~ 2 μg par PCR en utilisant l'ADN polymérase Phusion (NEB).

Des constructions acceptrices pour NTR1 de rat, contenant une cassette de clonage avec la séquence signal IgG de Mus musculus aa 1–17, ont été construites à la fois pour le plasmide d'expression de mammifère (sites de clonage EFMOD, Vaccinex, 5' BssHII et 3' SalI) et le plasmide de transfert de Vaccinia (sites de clonage VHEH5, Vaccinex, 5' BssHII et 3' BsiWI). Le gène NTR1 de rat de type sauvage (acides aminés 43–424), ainsi que les variants NTR1, L5X et TM86V, ont été amplifiés par PCR (ADN polymérase haute fidélité iProof, BioRad) et les amorces suivantes : NTRBSSHIIsense 5'-tttttGCGCACTCCACCTCGGAATCCGACACGG-3' et NTRaddSal1 5'-ttttGTCGACTCAGTACAGGGTCTCCC GGGTG-3' (pour EFMOD) ou NTRAddBsiW1stop-5'-tttttCGTACGtTCAGTACAGGGTCTC-3' (pour VHEH5) par des protocoles standards. Les produits de PCR ont ensuite été clonés dans les plasmides d'expression et de transfert. La construction de la banque d'ADN a été réalisée par PCR (Advantage2 polymérase, Clontech) de la banque de mutants 2218_-1_LIB_rNTR1 (43-424) en utilisant les mêmes amorces. Le produit de PCR a été résolu sur des gels à 1 % d'agarose/TBE. La bande de 1177 pb a été purifiée sur gel (Qiaquick, Qiagen), digérée et ligaturée dans le plasmide VHEH5 en utilisant l'ADN ligase NxGenT4 (Lucigen). Une transformation à haut rendement a été effectuée par électroporation de cellules NEB10Beta E. coli (BioRad GenePulser, cuvette de 1 mm, 2,0 kV, 200 Ω, 25 µF) pour créer une bibliothèque de plasmides avec une diversité d'environ 1,4 × 107.

Des constructions acceptrices pour le PTH1R humain avec une cassette de clonage contenant la séquence signal PTH1R aa 1–23 (y compris un site BsiWI naturel) et un site SalI 3 'ont été construites pour l'expression mammifère (EFMOD, Vaccinex) et le plasmide de transfert inductible de Vaccinia (T7terVHE, Vaccinex). Le gène PTH1R humain de type sauvage complet (1–593) a été amplifié par PCR (ADN polymérase Q5, NEB) et cloné dans des plasmides d'expression et de transfert (BsiWI/Sall). La construction de la bibliothèque d'ADN a été réalisée par PCR (Q5 DNA Polymerase, NEB) de l'ADN linéaire de la bibliothèque mutante SLN2248 avec des conditions standard et un cycle minimal en utilisant les amorces suivantes : PTH1Rsignalsense 5-CTCAGCTCCGCGTACGCGCTGGTG-3' et PTH1R AS 5'-TGTCCGTTCGGTCGACTCACATGACTGTCTCC-3'. Le produit de PCR a été résolu sur des gels à 1 % d'agarose/TBE. La bande de 1734 pb a été purifiée sur gel (Qiaquick, Qiagen), digérée avec BsiWI/Sall et ligaturée dans le plasmide T7TerVHE en utilisant l'ADN ligase NxGenT4 (Lucigen). La transformation à haut rendement a été décrite ci-dessus pour créer une bibliothèque de plasmides avec une diversité d'environ 6,3 × 106.

Le virus V7.5 du vecteur de la vaccine (Vaccinex) a été digéré avec la protéinase K (Thermo Fisher) et l'ADN a été purifié par extraction au phénol/chloroforme. L'ADN viral V7.5 a été digéré avec les endonucléases de restriction Apal (NEB) et NotI (NEB) et purifié avec des colonnes ultracentrifuges Amicon (Millipore Sigma). Les cellules BSC-1 ont été infectées avec le virus helper fowlpox à une multiplicité d'infection (MOI) de 1,5 unités formant plaque (pfu) par cellule et transfectées avec l'ADN du vecteur V7.5 digéré et chaque bibliothèque de récepteurs et les plasmides témoins correspondants. Les cellules infectées/transfectées ont été incubées pendant 5 jours et le virus de la vaccine a été récolté par congélation-décongélation des cellules. Des plages individuelles pour les clones témoins ont été prélevées et amplifiées. L'ADN viral a été purifié et amplifié par PCR. Les clones positifs ont été confirmés par séquençage. Le stock de virus pour la banque a été titré par dosage sur plaque. Les clones individuels ont été choisis au hasard et vérifiés par PCR pour l'efficacité de la recombinaison. Les bibliothèques de Vaccinia résultantes avaient une efficacité de recombinaison positive de plus de 95 %, hébergeant ~ 1, 3 × 108 et ~ 1, 1 × 108 recombinants uniques pour NTR1 et PTH1R, respectivement.

Les cellules A-431 ont été ensemencées la veille de l'infection dans du DMEM + 10 % (v/v) de FBS et laissées doubler pendant la nuit à 37 °C, 5 % de CO2. Les cellules ont ensuite été infectées pendant une nuit à une MOI de 1 pfu par cellule avec le virus exprimant les contrôles NTR1 ou la bibliothèque. Le pfu approprié de virus a été dilué dans un volume moyen minimal pour couvrir la monocouche cellulaire et incubé à 37 ° C, 5 % de CO2 pendant 1 à 2 h. Les cellules ont ensuite été recouvertes de suffisamment de milieu et laissées incuber pendant 16 à 18 h. Les cellules ont été récoltées à l'aide d'Accutase™, culottées et lavées dans un tampon FACS [PBS, 1 % (p/v) BSA] ou un tampon Tris [20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 118 mM NaCl, 5,6 mM glucose, 1,2 mM KH2PO4, 1,2 mM MgSO4, 4,7 mM KCl, 1,8 mM CaCl, 0,1 % (p/ v) BSA]. Les cellules ont été remises en suspension à 2 × 106 cellules par ml dans du tampon FACS ou du tampon Tris et incubées avec un ligand fluorescent sur de la glace pendant 1 à 2 h. Pour confirmer la spécificité, des échantillons de cellules en double ont également été incubés avec un excès de 100 fois de ligand non marqué. Les cellules ont ensuite été lavées dans le tampon approprié et fixées dans du paraformaldéhyde à 0,5 % avec de l'iodure de propidium pour la discrimination des cellules vivantes/mortes avant l'analyse sur le cytomètre en flux. La stratégie de déclenchement est illustrée dans la Fig. 8 supplémentaire.

Les cellules A-431, infectées par une bibliothèque de clones NTR1, ont été triées pour plusieurs itérations en utilisant 40 nM NT(8–13)-HL647. Pour le premier tour de tri, 4 × 107 cellules A-431 ont été infectées avec la bibliothèque NTR1 à un MOI de 1 pendant une nuit à 37 ° C, 5 % de CO2, comme décrit ci-dessus. Le jour suivant, les cellules ont été récoltées à l'aide d'Accutase™ et colorées avec 40 nM du ligand dans un volume total de 1 ml de tampon FACS sur de la glace pendant une heure avec un léger tourbillonnement occasionnel. Les cellules ont ensuite été lavées deux fois avec du tampon FACS, remises en suspension à 2 × 107 cellules par ml et passées à travers un filtre de 40 µm avant d'être triées sur le trieur BD FACS Aria. Les 0,3% de cellules fluorescentes supérieures ont été collectées (6800 au total), lysées par plusieurs cycles de congélation/décongélation et le virus a été amplifié dans plusieurs flacons de cellules BSC-1 pendant 2 à 3 jours.

Le virus amplifié a été récolté et titré avant d'être utilisé pour infecter à nouveau les cellules A-431 pour un deuxième tour de tri. Étant donné que la diversité du pool du premier tri n'était que de 6800, 3 × 106 cellules A-431 ont été infectées pour le second tri. Les 0,06 % d'événements supérieurs ont été collectés et amplifiés comme ci-dessus. L'enrichissement dans le tri a été testé par des infections à petite échelle et une coloration de ligand partout.

Les cellules A-431 infectées par une bibliothèque de clones PTH1R ont été triées pour plusieurs itérations en utilisant 120 nM M-PTH(1–14)-HL647 ou 120 nM PTH'(1–34)-HL647. Pour le premier tour de tri, 1, 2 × 108 cellules A-431 ont été infectées avec la bibliothèque inductible par PTH1R T7 et le virus promoteur T7 atténué à un MOI de 1 pendant la nuit à 37 ° C, 5% de CO2, comme décrit ci-dessus. Le jour suivant, les cellules ont été récoltées à l'aide d'Accutase™ et colorées avec 120 nM de ligand dans un volume total de 6 ml sur de la glace pendant une heure avec un léger tourbillonnement occasionnel. Les cellules ont ensuite été lavées deux fois avec du tampon FACS, remises en suspension à 2 × 106 cellules par ml et passées à travers un filtre de 40 µm avant d'être triées sur un trieur BD FACS Aria. Les 0,5 % de cellules fluorescentes supérieures ont été collectées, lysées par plusieurs cycles de congélation/décongélation, et le virus a été amplifié dans plusieurs flacons de cellules BSC-1 pendant 2 à 3 jours.

Le virus amplifié a été récolté et titré avant d'être utilisé pour infecter à nouveau les cellules A-431 pour un deuxième tour de tri. Chaque cycle de tri ultérieur a été effectué avec 1,5 × 107 cellules A-431 et la stringence de déclenchement a été augmentée pour chaque cycle. L'enrichissement en tri a été testé sous forme d'infections à petite échelle et de coloration de ligand partout.

L'ADN de la vaccine a été extrait des pools triés (DNA Blood mini, Qiagen). Les variants du pool ont été amplifiés à partir de l'ADN du pool en utilisant la PCR (polymérase Advantage2, Clontech) par des protocoles standard avec un cycle minimal. Pour NTR1, amorces NTRBSSHIIsense 5'-tttttGCGCGCACTCCACCTCGGAATCCGACACGG-3' et NTRaddSal1 5'-ttttGTCGACTCAGTACAGGGTCTCCCGGTGG-3' (EFMOD), et pour PTHR1, signal sens 5'-CTCAGCTCCGCGTACGCGCTGGTG-3' et PTHR1AS 5'-CCCCCCTCGAGGTCGACTCACAT GACTGTCTCCC-3'. Les produits de PCR ont ensuite été clonés dans le vecteur d'expression mammifère EFMOD. Des mini-bibliothèques ont été préparées en prélevant 92 à 94 colonies et en isolant l'ADN plasmidique (Qiaprep 96 turbo, Qiagen). Les séquences d'ADN ont été analysées par séquençage Sanger en utilisant 2 à 3 amorces pour une couverture complète.

Mini-Gs 393 a été essentiellement préparé comme décrit précédemment44. En bref, mini-Gs a été exprimé dans la souche E. coli BL21 (DE3) à 20 ° C. Les cellules ont été récoltées 16 à 20 h après l'induction par centrifugation, remises en suspension dans un tampon de lyse [40 mM HEPES (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM imidazole, 10 % (v/v) glycérol, 5 mM MgCl2, 50 μM GDP, 1 mM DTT, 50 μg/ml DNAseI, 50 μg/ml ly sozyme] et rompu dans un lyseur de cellules HPL6 (Maximator GmbH) à 1700 bars. Les lysats ont été clarifiés par centrifugation (20 000 g pendant 45 min) et les surnageants ont été chargés sur des colonnes Ni-NTA (Thermo Fisher Scientific). Les colonnes ont été lavées avec 10 CV de tampon de lavage [20 mM HEPES (pH 7,5), 500 mM NaCl, 28 mM imidazole, 10 % (v/v) glycérol, 1 mM MgCl2, 50 μM GDP, 1 mM DTT], et les protéines liées ont été éluées par étapes dans 2 CV de tampon d'élution [20 mM HEPES (pH 7,5), 150 NaCl mM, imidazole 500 mM, glycérol 10 % (v/v), MgCl2 1 mM, GDP 50 μM, DTT 0,5 mM]. L'imidazole a été éliminé sur des colonnes de dessalement PD-10 (Cytiva), les protéines ont été concentrées à 25 mg/ml et congelées instantanément dans un tampon de congélation [25 mM HEPES (pH 7,5), 150 mM NaCl, 15 % (v/v) glycérol, 5 mM MgCl2, 10 μM GDP, 0,25 mM DTT].

Des variants de récepteur ont été transfectés de manière transitoire dans des cellules HEK293T. 48 heures après la transfection, les cellules ont été détachées avec Accutase ™ et incubées avec 20 nM de HL488-NT (8–13) ou 100 nM de PTH' (1–34) -HL647 dans du PBS additionné de 0, 2% de BSA pendant 2 à 4 h sur glace. La liaison non spécifique a été déterminée en présence d'un excès de 100 fois de peptide non marqué. Les cellules ont ensuite été lavées trois fois avec du PBS glacé et les intensités de fluorescence ont été déterminées sur un cytomètre en flux FACSCanto II (BD Biosciences).

Des expériences de liaison de ligand ont été réalisées sur des cellules entières ou sur des membranes cellulaires obtenues à partir de cellules HEK293T transfectées de manière transitoire, en utilisant dans les deux cas un test de liaison HTRF comme décrit précédemment 11,14. Tous les variants de récepteur ont été sous-clonés dans un vecteur d'expression de mammifère contenant une étiquette SNAP N-terminale (Cisbio). Pour les constructions NTR1, l'étiquette SNAP a été fusionnée au résidu 43 du récepteur. Pour PTH1R, l'étiquette SNAP a été fusionnée au résidu 29 ou au résidu 171, éliminant ainsi l'ECD. Les cellules HEK293T ont été transfectées de manière transitoire avec des constructions de récepteurs et ont été ensemencées à 20 000 cellules par puits dans des plaques à 384 puits recouvertes de poly-L-lysine (Greiner) pour des tests de liaison de cellules entières ou à 5 × 106 cellules dans des boîtes de Petri de 10 cm pour la préparation de membranes. 48 h après la transfection, les cellules ont été incubées avec 50 nM de SNAP-Lumi4-Tb (Cisbio) dans un tampon de liaison au ligand [HEPES 20 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, MgCl2 3 mM et 0,02 % (p/v) BSA] pendant 2 h à 37 °C. Les cellules ont été lavées quatre fois avec un tampon de test et utilisées directement pour des expériences de liaison de ligand de cellules entières, ou des extraits bruts de membrane cellulaire ont été préparés comme décrit précédemment. Des cellules ou des membranes de 0, 2 à 1 µg par puits ont ensuite été incubées pendant 4 h sur de la glace pour mesurer la liaison du ligand, contenant un peptide traceur marqué par fluorescence avec une plage de concentration de peptide concurrent non marqué. Pour NTR1, 2 nM de HL488-NT(8–13) ont été utilisés comme peptide traceur. Pour PTH1R, 50 nM de M-PTH(1–14)-HL647 ou 20 nM de PTH'(1–34)-HL647 ont été utilisés. Les intensités de fluorescence ont été mesurées sur un lecteur de plaque de fluorescence Spark (Tecan) avec une longueur d'onde d'excitation de 340 nm et des longueurs d'onde d'émission de 620 nm, 520 nm et 665 nM pour Tb3+, HiLyte Fluor 488 et HiLyte Fluor 647, respectivement. Le rapport des intensités de fluorescence du donneur et de l'accepteur de FRET a été calculé. La liaison totale a été obtenue en l'absence de compétiteur, et la liaison non spécifique a été déterminée en présence d'un excès de 100 fois de peptide non marqué. Les données ont été normalisées à la liaison spécifique pour chaque expérience individuelle et ont été analysées par ajustement global à une équation de compétition hétérologue à un site.

Des expériences de signalisation ont été réalisées sur des cellules entières avec des cellules HEK293T transfectées de manière transitoire comme décrit précédemment11,14. Vingt-quatre heures après la transfection, les cellules ont été lavées avec du PBS, détachées avec du tampon de dissociation cellulaire (Gibco) et lavées à nouveau dans du PBS. Les cellules ont été remises en suspension dans un tampon de test [Hepes 10 mM (pH 7,4), NaCl 146 mM, CaCl2 1 mM, MgCl2 0,5 mM, KCl 4,2 mM, glucose 5,5 mM, LiCl 50 mM, 3-isobutyl-1-méthylxanthine 1 mM). Les tests d'accumulation d'AMPc et d'IP1 ont été effectués sur des plaques blanches à 384 puits à faible volume (Greiner) en utilisant respectivement le kit cAMP Tb et le kit IP-One Tb (tous deux de CisBio), selon le protocole du fabricant. Pour l'accumulation d'AMPc, 5000 cellules ont été incubées avec l'agoniste aux concentrations indiquées pendant 30 min à température ambiante. Pour déterminer la signalisation du récepteur basal, les cellules ont été incubées dans un tampon de dosage contenant de l'isobutylméthylxanthine (IBMX) pendant 30 min en l'absence de ligand. Pour l'accumulation d'IP1, 20 000 cellules ont été incubées avec l'agoniste aux concentrations indiquées pendant 2 h à 37 °C. Les intensités de fluorescence ont été mesurées sur un lecteur de plaque de fluorescence Spark (Tecan). Pour générer des courbes concentration-réponse, les données ont été ajustées à une équation logistique à trois paramètres.

La stabilité des variants de récepteurs évolués a été mesurée dans des fractions membranaires de cellules HEK293T transfectées de manière transitoire en déterminant le ligand résiduel lié au récepteur après une provocation thermique des membranes. Dans le cas de PTH1R, l'ECD (résidus 1 à 170) a été retiré des constructions d'expression pour limiter les mesures de stabilité au TMD. Pour NTR1, les cellules n'ont pas été modifiées, tandis que pour PTH1R, les cellules ont été marquées avec 50 nM de SNAP-Lumi-4Tb avant que les membranes ne soient préparées comme décrit ci-dessus. Les membranes ont ensuite été incubées pendant 2 à 4 h sur de la glace dans un tampon de liaison au ligand contenant 20 nM de [3,11-tyrosyl-3,5-3H(N)]-neurotensine (Perkin Elmer) et 500 nM de M-PTH(1–14) -HL647 pour NTR1 et pour PTH1R, respectivement. Lorsque cela est indiqué, 25 uM de protéine mini-Gs ont été ajoutés aux fractions membranaires avant l'ajout de ligand. Par la suite, 0,5 µg de membranes ont été distribuées par puits d'une plaque de 96 puits et chauffées à une température spécifique dans un thermocycleur PCR pendant 20 min. Les membranes contenant NTR1 ont ensuite été immobilisées sur des filtres en fibre de verre (Millipore), lavées quatre fois avec un tampon de liaison, et l'activité résiduelle du radio-ligand a été mesurée sur un compteur à scintillation liquide MicroBeta Plus 1450 (Perkin Elmer). Pour PTH1R, la liaison résiduelle du ligand a été déterminée par HTRF comme décrit ci-dessus. Les données ont été analysées par ajustement de régression non linéaire.

Les données de cytométrie en flux ont été analysées dans le logiciel FlowJo V10 (BD Biosciences). La collecte et l'analyse des données ont été effectuées dans Microsoft Excel V2108. Toutes les autres analyses statistiques et ajustements de courbe ont été effectués dans Prism V6.07 (GraphPad). Les détails de chaque analyse sont décrits dans la section des méthodes expérimentales, les figures, les tableaux et les légendes des figures de l'expérience spécifique. Les alignements de séquences et les parcelles de serpent ont été obtenus à partir du GPCRdb58. L'analyse de séquence a été effectuée avec CLC Workbench V22.0.2. Les fréquences de séquence ont été visualisées avec WebLogo59. Les structures protéiques ont été analysées et visualisées avec PyMOL V2.8.2. La signification statistique des différences a été déterminée par ANOVA unidirectionnelle et multi-comparaison de Bonferroni.

Aucune méthode statistique n'a été utilisée pour prédéterminer la taille de l'échantillon. Aucune donnée n'a été exclue des analyses. Les expériences n'étaient pas randomisées. Les enquêteurs n'ont pas été aveuglés à l'allocation pendant les expériences et l'évaluation des résultats.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Toutes les données nécessaires pour évaluer les conclusions de l'article sont présentes dans l'article et/ou dans les informations supplémentaires. Entrées PDB accessibles au public utilisées dans ce travail : 4BUO, 4L6R). Les données de séquence de récepteur utilisées dans cet article sont disponibles auprès de GPCRdb. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Nous remercions Frank Murante et Kari Viggiani pour leur assistance technique experte. Nous tenons également à remercier Pascal Egloff pour ses précieuses contributions à la conception de la bibliothèque. Ce travail a été soutenu par une bourse de l'Académie allemande des sciences Leopoldina (LPDS 2009-48) et une bourse Marie Curie de la Commission européenne (FP7-PEOPLE-2011-IEF #299208) à CK et par une subvention du Schweizerische Nationalfonds (31003A_182334) à AP

Département de biochimie, Université de Zurich, Winterthurerstrasse 190, CH-8057, Zurich, Suisse

Christoph Klenk, Anina Niederer & Andreas Plückthun

Vaccinex, Inc., 1895 Mt. Hope Avenue, Rochester, New York, 14620, NY, États-Unis

Maria Scrivens, Shuying Shi, Loretta Mueller, Elaine Gersz, Maurice Zauderer et Ernest S. Smith

MorphoSys AG, Semmelweisstr. 7, 82152, Planegg, Allemagne

Ralph Strohner

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Recherche conçue par CK, ESS, MZ et AP ; CK, MS, AN, SS, LM et EG ont effectué des recherches ; RS a fourni de nouveaux réactifs ; CK, MS, AN, ESS, MZ et AP ont analysé les données ; CK et AP ont rédigé l'article.

Correspondance à Christoph Klenk ou Andreas Plückthun.

MS, SS, LM, EG, MZ et ESS sont des employés de Vaccinex, Inc. et détiennent des actions et/ou des options sur actions dans l'entreprise. RS est un employé de MorphoSys AG et déclare qu'il n'existe aucun intérêt concurrent. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Bryan Roth et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Des rapports d'examen par les pairs sont disponibles.

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Réimpressions et autorisations

Klenk, C., Scrivens, M., Niederer, A. et al. Un système basé sur la vaccine pour l'évolution dirigée des GPCR dans les cellules de mammifères. Nat Commun 14, 1770 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37191-8

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Reçu : 10 novembre 2022

Accepté : 06 mars 2023

Publié: 30 mars 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-37191-8

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