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Aug 04, 2023

Modification et préparation efficaces d'ADN circulaire pour l'expression en culture cellulaire

Volume Biologie des communications

Communications Biology volume 5, Article number: 1393 (2022) Citer cet article

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Les plasmides d'ADN sont un outil essentiel pour la livraison et l'expression des ARN et des protéines dans les expériences de culture cellulaire. La préparation de plasmides implique généralement un processus laborieux de clonage bactérien, de validation et de purification. Bien que les plasmides d'expression puissent être conçus et commandés auprès des sous-traitants, le coût peut être prohibitif lorsqu'un grand nombre de plasmides est requis. Nous avons développé une méthode et un protocole entièrement synthétiques efficaces qui permettent la production d'ADN circularisé contenant des éléments d'expression prêts pour la transfection en aussi peu que 3 heures, éliminant ainsi les étapes de clonage bactérien. Le protocole décrit comment prendre un fragment d'ADN double brin linéaire et efficacement circulariser et purifier ce fragment d'ADN avec un temps de manipulation minimal. Comme preuve du principe, nous avons appliqué le vecteur circulaire exprimant l'ARN guide d'édition principal (epegRNA) dans la culture cellulaire, et démontré la correspondance et même le dépassement des performances de cette méthode par rapport aux guides exprimés par les plasmides. La rapidité de préparation, le faible coût et la facilité d'utilisation de la méthode en feront un outil utile dans les applications nécessitant l'expression d'ARN courts et de protéines.

De nombreuses techniques existent pour la préparation et la délivrance d'ARN et de protéines pour une expression transitoire dans des cultures cellulaires1. Dans cette étude, nous présentons une méthode de préparation nouvelle et efficace. A titre de démonstration, nous décrirons l'utilisation de notre méthode dans le contexte d'application d'édition de gènes. Cependant, étant donné que le principe de cette méthode est générique, cette méthode peut être utile à diverses fins et applications qui nécessitent l'expression d'ARN et de protéines. Bien que nous discuterons de la mise en œuvre spécifique de l'édition de gènes et comparerons notre méthode avec certaines techniques de préparation existantes, le but de cet article est de présenter une nouvelle approche pour préparer les vecteurs d'expression dans un environnement de laboratoire, et non une méthode d'édition de gènes plus efficace en tant que telle.

Les trois approches les plus courantes qui facilitent l'édition de gènes lorsqu'elles sont livrées dans des cellules sont : (I) des plasmides simples ou multiples2 codant pour Cas9 et d'autres protéines supplémentaires et des implémentations d'ARN guide adaptées à CRISPR/Cas9 traditionnel, à l'édition de base, à l'édition principale ou à d'autres méthodes3,4,5,6 ; (II) ARNm Cas9 et ARN guide7 ; (III) Protéine Cas9 complexée avec des ARN guides8. Diverses méthodes de délivrance à partir des constructions d'édition de gènes susmentionnées sont actuellement utilisées. Le choix de la méthode de livraison dépendra des exigences spécifiques et des préférences du chercheur, qui peuvent inclure l'électroporation9,10, la lipofection11, la transfection physique directe12, la livraison vectorielle sur des particules de polymère et des microporteurs13, et les modalités des méthodes susmentionnées.

L'approche (I), l'édition de gènes utilisant la transfection de plasmide pour l'expression transitoire est couramment utilisée en raison de sa simplicité conceptuelle, de sa facilité de manipulation et de la stabilité des plasmides. Cependant, la préparation des plasmides est un processus laborieux et chronophage qui prend généralement 2 jours2 (référez-vous aux étapes typiques de clonage bactérien dans la note complémentaire 1).

Nous avons développé une méthode et un protocole entièrement synthétiques efficaces qui permettent la production d'ADN circularisé contenant des éléments d'expression prêts pour la transfection en aussi peu que 3 h, éliminant ainsi les étapes de clonage bactérien. L'ADN circularisé est résistant à la dégradation par les exonucléases dans le cytoplasme14. L'ADN linéaire manque d'une telle stabilité, ce qui constitue un obstacle important à son utilisation pour la délivrance de gènes. De plus, notre méthode tire parti de cette différence de propriétés en utilisant une exonucléase pour digérer des fragments d'ADN linéaire n'ayant pas réagi ou ayant mal réagi, purifiant ainsi l'ADN circulaire.

Nous avons déterminé que la plage pratique de la longueur du vecteur d'expression se situe entre 450 et 950 pb, où elle atteint jusqu'à 62 % d'efficacité de conversion de l'ADN double brin linéaire d'entrée (ADNdb) en vecteurs d'expression circulaires ; la méthode pourrait également être utilisée avec une efficacité moindre pour des fragments un peu plus longs. Par souci de brièveté, de cohérence et pour éviter toute confusion avec la description des étapes de préparation et du produit final dans cet article, nous ferons référence à cette construction et à cette méthode de vecteur d'expression d'ADN circulaire en tant que vecteur circulaire, en majuscules et en italique.

Pour démontrer que ces constructions d'ADN circulaires peuvent fonctionner comme vecteurs d'expression, nous avons appliqué cette méthode pour créer de l'ADN circulaire pour exprimer l'ARN guide d'édition principal (epegRNA)5,15,16, et nous avons édité avec succès trois emplacements génomiques qui ont été présentés par Chen et al.15, résultant en une efficacité d'édition comparable.

L'objectif de cette recherche était de développer et de valider une méthode efficace de préparation à tube unique pour la livraison et l'expression d'ARN et de protéines dans des expériences de culture cellulaire. La circularisation des guides d'édition principaux a été effectuée en suivant le protocole décrit dans la section Méthodes et schématiquement illustré à la Fig. 1.

un élément d'expression contenant des sites de reconnaissance d'enzymes de restriction de type IIS avec des surplombs complémentaires aux deux extrémités du fragment d'ADN. b Les coupures par l'enzyme de restriction et la ligature des surplombs résultants forment l'élément d'expression d'ADN circulaire. L'exonucléase T5 est utilisée pour digérer tout l'ADN non circularisé. c Vue schématique des surplombs complémentaires de 4nt (gtac) créés par des coupes d'enzymes de restriction (BsaI GGTCTC), voir la Fig. ase à 65 oC pendant 15 min. Si laissé sans surveillance, réglez le cycleur de programme pour faire une pause à 4 oC. e Ajouter un volume égal de réactifs d'exonucléase T5 dans le même tube et digérer à 37 oC pendant 1 h. f Purifiez la construction d'expression d'ADN circularisée du mélange réactionnel à l'aide d'un kit de nettoyage d'ADN.

Le rendement relatif de la réaction (voir Fig. 2a) est défini dans l'Eq. (1) par le rapport de la quantité d'ADN circularisé après purification au rendement maximal théorique possible en excluant les sites d'enzymes de restriction et le rembourrage d'extrémité d'ADN ou les adaptateurs PCR (voir la Fig. 1 supplémentaire et une description plus détaillée dans la section Méthodes). La longueur typique de la construction d'expression d'epegRNA PEmax circularisée serait comprise entre 450 et 500 pb, y compris le promoteur et la séquence codant pour le pegDNA avec la boucle d'ARN terminale, comme décrit dans Chen et al.15. Pour cette recherche, nous avons choisi un vecteur circulaire de 452 pb codant pour une seule substitution de nucléotide dans le gène HBB15. Nous avons conçu un ensemble d'ADNdb avec des longueurs de rembourrage variables composées de séquences d'ADNdb randomisées pour tester comment le rendement dépend de la longueur d'entrée d'ADNdb et de la durée de l'étape de circularisation (ligature). L'ajout d'un tel rembourrage d'ADN de 100, 300, 500, 880 et 1330 pb à un vecteur circulaire de 452 pb d'os nus a donné des vecteurs circulaires de 552, 752, 952, 1332 et 1782 pb (voir Fig. 1 supplémentaire). De plus, nous avons testé une structure circularisée raccourcie de 282 pb qui était trop courte pour contenir un vecteur d'expression fonctionnel dans notre implémentation mais qui était intéressante du point de vue de la vérification du comportement de constructions potentiellement plus courtes.

a Rendement relatif à une gamme de longueurs d'ADN d'entrée à 1, 2 et 12 h de circularisation. Les nœuds de ligne représentent les moyennes de n = 2–3 échantillons de réaction indépendants ; les points montrent des échantillons de données individuels pour les nœuds, décalés horizontalement pour la visibilité. b Image combinée d'électrophorèse sur gel. Dans chaque sous-parcelle, Lane 1 = 1 h, Lane 2 = 2 h et Lane 3 = 12 h de circularisation. La quantité d'ADN a été normalisée à 300 ng par piste dans les sous-parcelles 282–952 bp. Pour éviter une surcharge due au petit nombre de bandes, la quantité d'ADN a été normalisée à 150 ng par voie pour les sous-parcelles de 1332 et 1782 pb. Les voies de chaque sous-parcelle sont un sous-ensemble de voies d'une même plaque de gel unique pour chaque longueur de vecteur circulaire, recadrée uniquement pour réduire le nombre de voies sans aucune amélioration d'image ; les photographies complètes du gel sont disponibles dans les données supplémentaires. c Diagramme schématique de l'auto-circularisation et de la jonction de plusieurs fragments répétés.

Le rendement relatif du protocole pour les longueurs de vecteur circulaire testées et les durées de circularisation est présenté à la Fig. 2a. Notamment, le rendement était le plus élevé pour la gamme de longueurs d'ADN circulaires coïncidant avec les longueurs de nos principaux vecteurs d'édition (à 450 pb ou plus). En excluant ce pic de haut rendement, le rendement est resté relativement constant et a chuté rapidement pour les longueurs supérieures à 1000 pb.

Les résultats de l'électrophorèse sur gel montrent une image contenant exclusivement de l'ADN circularisé dans plusieurs bandes (voir Fig. 2b). Comme prévu, en plus de la circularisation d'une seule unité, certaines ligatures ont donné des concatémères en double, en triple et d'ordre supérieur, qui sont représentés schématiquement sur la figure 2c. Cette hypothèse a été confirmée en découpant, purifiant et séquençant des bandes individuelles, ainsi qu'en réexécutant une électrophorèse sur gel sur de l'ADN purifié à partir de bandes individuelles. Dans chaque cas, le séquençage Sanger a confirmé la correspondance parfaite entre les conceptions et les vecteurs circulaires construits. La majeure partie de la circularisation s'est produite au cours de la première heure, dépassant 48 % à une taille de 452 bp et diminuant à 26 % à 952 bp, ce qui en fait une méthode pratiquement utile dans toute cette gamme de longueurs. Sans surprise, alors que le rendement augmentait encore avec l'augmentation de la durée de circularisation/ligature, la proportion de combinaisons d'ordre supérieur augmentait également avec la durée de ligature (voir les images de gel sur la figure 2b).

L'analyse des images d'électrophorèse sur gel à l'aide du logiciel ImageJ des National Institutes of Health a montré que la représentation de la bande supérieure par le poids de l'ADN augmentait légèrement avec la durée de circularisation (voir Fig. 3a). Ceci est particulièrement visible lorsque l'on compare la bande 1 (ADN circulaire unique, ligne bleue) à la valeur cumulée des bandes 3 et supérieures (ligne jaune). Ce n'est qu'à une taille de vecteur circulaire de 282 bp que la bande 1 du simplexe représente moins que la bande 2 et moins que la valeur combinée des bandes 3 et supérieures des unités vectorielles en poids dans la sortie de réaction.

Nous montrons la première, la deuxième et la somme des troisièmes bandes et des bandes supérieures correspondant aux concatémères simples, doublés et à la somme des concatémères d'ordre supérieur. Les nœuds de ligne représentent les moyennes de n = 2 échantillons de réaction indépendants calculés à partir de la luminosité de la bande d'électrophorèse sur gel ; les points montrent des échantillons de données individuels pour les nœuds, décalés horizontalement pour la visibilité. a Le poids relatif de l'ADN est égal à la luminosité relative de la bande. b Le compte molaire relatif de la bande est compté comme la luminosité relative de la bande divisée par le numéro de la bande (voir également l'équation (2)).

Le nombre d'unités molaires est toujours relativement élevé pour la bande 1 puisque la représentation molaire est proportionnelle au poids de l'ADN de la bande divisé par le numéro de la bande (voir Fig. 3b). Pour une durée de ligature de 1 h dans un vecteur circulaire entre 450 et 950 pb de longueur, la bande 1 fait une fraction molaire d'environ 70 %, la bande 2 représentant 20 % supplémentaires et les bandes d'ordre supérieur combinées représentant les 10 à 15 % restants. À 12 h de ligature, la part de la bande 1 se déplace vers le bas d'environ 6 %, tandis que la bande 2 reste plutôt constante, et la part des bandes supérieures combinées a augmenté d'environ 6 %. Cela représente une augmentation du poids des bandes d'ordre supérieur avec un rendement supplémentaire minimal, voire nul, pour les vecteurs circulaires à une seule unité.

A l'inverse, au dessus de 1000 pb, les bandes supérieures se combinent en dessous de 5% de fraction molaire. Cependant, en raison de leur faible rendement de 5 à 8 %, nous considérons que ces vecteurs circulaires plus longs ne sont pratiquement pas utiles dans notre méthode. Nous émettons l'hypothèse que ces changements dans la longueur de l'ADN d'entrée pour le rendement et la distribution des fractions de concatémères de vecteurs circulaires joints - y compris le pic apparent de rendement autour de 450 pb - sont probablement causés par une combinaison de longueur d'ADN et de modèles de pliage affectés par le pH du mélange réactionnel, les influences ioniques et la température de réaction18.

Alors que la majorité des vecteurs circulaires en nombre sont composés d'unités simples et doubles, les concatémères d'ordre supérieur sont représentés de manière disproportionnée en poids. Pour la transfection, il est important de pouvoir calculer une proportion molaire du plasmide porteur de Cas9 et du plasmide guide. L'efficacité de la transfection plasmidique est toujours inférieure à 100 % des cellules et varie en fonction du type de cellule, de la taille du ou des plasmides et des méthodes de transfection. La détermination du rapport parfait lors de la co-transfection de deux plasmides est laborieuse19, et lorsque deux plasmides co-transfectés diffèrent en taille, un excès molaire du plus petit plasmide est habituellement utilisé, voir par exemple Bosch et al.20. Dans nos principales expériences de validation d'édition, les vecteurs circulaires sont cinq fois plus petits que les plasmides exprimant l'epegRNA16 qu'ils remplacent, tandis que ces plasmides epegRNA16 sont eux-mêmes environ cinq fois plus petits que les plasmides correspondants exprimant Cas915 (voir la discussion plus loin). Ainsi, nous calculons un "multiplicateur molaire" qui indique combien de vecteur circulaire en poids doit être utilisé par rapport au cas d'un vecteur circulaire pur à une seule unité utilisant l'équation (2). Les valeurs de multiplicateur molaire pour 1 h et 12 h de ligature sur la figure 4a impliquent qu'une durée de ligature plus longue entraîne une augmentation du rapport molaire en raison d'une augmentation prédominante de la fraction de bande supérieure.

a Multiplicateur molaire par longueur et durée de circularisation. Entre 452 bp et 952 bp, une règle empirique simple basée sur la distribution est un multiplicateur de 1,5 × après 1 h de circularisation et de 1,7 × pour 2 h de circularisation ou plus. Par exemple, si le plasmide Cas9 a une longueur de 13 000 bp et un seul vecteur circulaire a une longueur de 452 bp, alors 1,0 μg du plasmide principal au rapport molaire 1:1 nécessitera 1,0 × 452/13 000 = 0,035 μg = 35 ng. Multiplier par 1,5 se traduira par 52 ng d'un vecteur plutôt que 35 ng pour un rapport molaire 1:1 basé sur une réaction de circularisation de 1 h. Les nœuds de ligne représentent les moyennes de n = 2 échantillons de réaction indépendants calculés à partir de la luminosité de la bande d'électrophorèse sur gel ; les points montrent des échantillons de données individuels pour les nœuds, décalés horizontalement pour la visibilité. b Validation du vecteur circulaire par édition primaire HBB, CDKL5 et PRPN.

La validation de la fonctionnalité du vecteur circulaire a été effectuée par édition primaire des substitutions de base unique dans la culture cellulaire HEK293T à trois emplacements génomiques (c'est-à-dire HBB, PRPN et CDKL5) qui ont été utilisés par Chen et al.15 comme démonstration de l'efficacité améliorée de leur méthode PEmax. Nous avons codé la conception du guide à partir d'une étude de Nelson et al.16, en conjonction avec le plasmide Addgene #17482815,21, qui a été modifié avec l'ajout d'un gène de résistance à la blasticidine pour faciliter une sélection antibiotique. Nous avons utilisé l'électrophorèse sur gel pour purifier la première bande des vecteurs circulaires HBB, PRPN et CDKL5 préparés, obtenant ainsi le vecteur circulaire du module d'expression unique. Nous avons également préparé un ensemble des trois mêmes unités d'expression avec 500 pb ajoutés de rembourrage d'ADN inactif avant le promoteur U6, comme décrit ci-dessus et illustré à la Fig. Nous avons vérifié que l'utilisation du rapport molaire 8X du vecteur circulaire aux plasmides Cas9 produisait une différence négligeable dans l'efficacité de l'édition par rapport au rapport 4X, et nous avons donc effectué toutes les expériences d'édition du génome rapportées ici avec l'excès molaire 4X habituel.

L'analyse de l'efficacité de l'édition effectuée avec EditR22,23 est résumée dans le tableau 1 et illustrée à la figure 4b. Il est évident que les vecteurs circulaires sont fonctionnels pour l'expression de l'epegARN lorsqu'ils sont utilisés comme composant de l'édition principale, en utilisant un excès molaire 4X de vecteurs circulaires par rapport au plasmide PE4max Cas9. L'efficacité d'édition était proche des résultats PE4max rapportés par Chen et al.15 pour deux emplacements édités sur trois, et dépassait considérablement l'efficacité d'édition de Chen et al.15 pour le troisième emplacement, le locus PRNP, validant ainsi l'utilisation fonctionnelle des vecteurs circulaires. Notamment, l'utilisation des vecteurs circulaires tels que préparés par notre protocole a entraîné une meilleure efficacité d'édition que le vecteur circulaire à bande unique purifié, validant ainsi l'avantage d'utiliser le mélange contenant une fraction de concatémères, plutôt que les unités circularisées simples. Les vecteurs circulaires avec un rembourrage supplémentaire de 500 bp ont affiché une efficacité d'édition supérieure de 1 à 4 % (marquée en gras dans le tableau 1).

Nous avons émis l'hypothèse de deux mécanismes conduisant aux résultats observés dans le tableau 1 : (A) Peut-être que des unités circulaires très courtes de 452 pb interagissent légèrement moins efficacement avec la polymérase III que des structures circulaires plus longues24, et doubler la longueur peut rendre l'interaction légèrement plus efficace, ce qui peut expliquer la petite augmentation observée de l'efficacité entre les colonnes CV et CV+500 pad, qui contenaient les 500 pb supplémentaires de rembourrage d'ADN inactif. Lorsqu'une efficacité d'édition maximale est requise, le rembourrage d'ADN supplémentaire peut être facilement incorporé dans la conception du vecteur circulaire, comme dans la Fig. 1 supplémentaire. (B) L'augmentation plus importante de l'efficacité d'édition entre les colonnes CV et CV de la bande 1 peut s'expliquer par environ 1,5 fois plus grand nombre d'unités d'expression par unité molaire du mélange concatémère de vecteurs circulaires par rapport aux unités d'expression circularisées uniques; de plus, les vecteurs circulaires concaténés sont automatiquement plus longs. Cela implique également qu'une durée de circularisation prolongée, entraînant une représentation plus élevée des vecteurs circulaires concaténés, peut également améliorer légèrement l'efficacité de l'édition à un excès molaire fixe.

En résumé, les résultats ci-dessus ont démontré que les vecteurs circulaires de 450 à 950 pb préparés à l'aide de notre protocole conviennent à la délivrance et à l'expression d'ARN pour une utilisation en tant que vecteurs d'expression d'epegRNA dans l'édition principale dans des cultures cellulaires.

La méthode et le protocole de circularisation présentés ici décrivent comment préparer des vecteurs circulaires qui peuvent être utilisés comme un remplacement efficace pour les plasmides guides dans CRISPR, la base et l'édition de gènes principaux dans les cultures cellulaires. Le principal avantage de cette méthode est qu'après la conception, la commande et la réception d'ADNdb auprès d'un fournisseur commercial, le produit prêt pour la transcription peut être préparé pour être utilisé dans les 3 h, avec peu de temps pratique. De plus, la majorité du temps pratique consiste en le nettoyage de base de l'ADN du kit de colonne de centrifugation. Si la quantité d'ADN reçue est faible et qu'une amplification par PCR est requise, le processus peut prendre une heure supplémentaire pour amplifier la quantité nécessaire d'ADN d'entrée.

Il y a deux principales limites ou préoccupations dont nous souhaitons discuter :

La quantité de vecteur circulaire produit par une réaction de synthèse. En règle générale, une seule réaction de 50 μl produira 2,0 à 2,5 μg de produit. Bien que la réaction puisse être étendue avec plus de réactifs, dans les situations où une grande quantité de vecteurs est nécessaire, la capacité du clonage bactérien à produire des milligrammes de produit dans une maxi-préparation en fera un meilleur choix. Dans la plupart des situations, seules quelques modifications sont apportées à chaque guide, ainsi la simplicité et la rapidité de préparation favorisent notre méthode de circularisation.

Nous aimerions discuter du taux d'erreur inhérent au processus de fabrication des fragments d'ADN. La haute fidélité est une suite forte de la méthode de clonage bactérien. Le taux d'erreur de réplication de l'ADN d'E. coli lors du clonage d'un plasmide est estimé à 5 ⋅ 10−10 par paire de bases25. Une fois qu'une colonie d'E. coli contenant un plasmide parfait est identifiée par séquençage et clonée, les chances qu'un plasmide contienne une erreur sont extrêmement faibles, à condition que des précautions soient prises26.

D'autre part, le taux d'erreur annoncé par les fabricants commerciaux de fragments d'ADN est assez élevé. Les taux d'erreur des fragments d'ADN de moins de 800 pb produits par trois fabricants sont : Twist Bioscience 1/6253 pb, Thermo Fisher Scientific 1/6757 pb et Integrated DNA Technologies 1/6757 pb. Notamment, Twist Bioscience27 et Thermo Fisher Scientific28 affirment que le taux d'erreur réel pour les gBlocks d'Integrated DNA Technologies est beaucoup plus élevé (respectivement 1/2705 et 1/1329).

Prenons l'exemple du processus de fabrication Twist Bioscience - avec un taux d'erreur de 1/6253 bp - et notre vecteur circulaire de 452 bp avec un espaceur de ciblage de 20 bp de long. Ainsi, la probabilité qu'une erreur se produise dans l'entretoise est d'environ 20 ÷ 6, 253 ≈ 1/312 pour les vecteurs circulaires. Plus probablement qu'autrement, ils ne trouveront aucune cible dans le génome et pourraient conduire à des tentatives d'édition hors cible dans une très petite proportion de cette fraction déjà faible de 1/312 de guides potentiellement incompatibles. Cette conclusion est étayée par Chavez et al.29 qui ont démontré que les modifications peuvent être tolérantes à de multiples inadéquations entre l'ARNg et le locus lié de manière inappropriée. En supposant qu'une erreur se produise dans la zone du promoteur de 264 pb (voir Fig. 1 supplémentaire), elle la laissera fonctionnelle ou la rendra non fonctionnelle. Si le promoteur n'est pas fonctionnel, cela n'aura aucun effet sur l'exactitude de la modification. De même, si l'erreur tombe dans la zone d'échafaudage de l'ARN, le lieur, l'extension ou la boucle d'extrémité rendra très probablement l'epegRNA non fonctionnel, également sans effet sur la précision de l'édition. De plus, les vecteurs circulaires sont généralement fournis en excès du plasmide Cas9, et les vecteurs circulaires non fonctionnels seront soutenus par des vecteurs fonctionnels.

Ainsi, le taux d'erreur supplémentaire introduit par les vecteurs circulaires devrait être d'un ordre de grandeur inférieur à celui produit par l'édition principale elle-même et, dans une mesure encore plus grande, CRISPR/Cas9 et l'édition de base3,4,5,15,30, car toutes ces méthodes présentent intrinsèquement un niveau de 4 à 15 % de hors cible et de mauvaises modifications. L'analyse de trace Sanger menée avec EditR pour nos trois emplacements génomiques modifiés n'a pas indiqué de modifications hors cible notables, ce qui est cohérent avec le raisonnement susmentionné selon lequel les modifications hors cible avec l'utilisation de la méthode des vecteurs circulaires, le cas échéant, seront des ordres de grandeur moins fréquentes que les modifications réussies.

Dans certains cas, lorsque plusieurs ARN doivent être exprimés, une solution peut être mise en œuvre avec des guides polycistroniques31. Les promoteurs U6 expriment l'ARN sans séquences de localisation nucléaire supplémentaires présentes sur un plasmide16,32,33, et nos expériences de validation l'ont confirmé pour les vecteurs circulaires. Lors de la mise en œuvre d'autres promoteurs, la conception - comme pour les plasmides - peut avoir besoin d'assurer la localisation nucléaire34,35.

Il existe certaines situations où deux ARN ou plus doivent être exprimés qui nécessitent des promoteurs séparés, ou plusieurs répétitions sont présentes dans la conception d'ADNdb souhaitée. Par exemple, les méthodes d'édition principales PE3 ou PE5max15 nécessitent un deuxième guide d'ARN pour produire une entaille supplémentaire. Des scénarios encore plus complexes existent6,36. Dans de tels cas, plusieurs éléments peuvent être combinés dans un vecteur circulaire. La plupart des fabricants ne peuvent pas fabriquer de fragments d'ADN avec de longues répétitions (par exemple, des promoteurs répétitifs ou des échafaudages pegRNA). Cependant, l'ADNdb peut être commandé sous forme de fragments séparés et l'exécution de l'étape supplémentaire facile de ligature linéaire peut préparer un ADNdb linéaire combiné qui peut ensuite être circularisé par la méthode du vecteur circulaire (voir la Fig. 2 supplémentaire et la note supplémentaire 3 : Jointure linéaire de fragments d'ADNdb). Par exemple, l'édition primaire PE3 et PE515 nécessitent deux promoteurs U6 qui permettent la transcription de deux guides d'ARN. Les constructions correspondantes sont habituellement insérées dans un vecteur plasmidique unique en utilisant l'assemblage Golden Gate ou Gibson, suivi d'un clonage bactérien. Dans un scénario encore plus complexe, de nombreuses étapes d'assemblage et de clonage bactérien impliquent ~1 semaine de travail et de manipulation36. En principe, l'étape de jonction nécessite la conception et la commande de fragments pouvant être coupés avec une enzyme de restriction IIS de type intermédiaire (c'est-à-dire BbsI dans l'exemple présenté dans la Fig. 2 supplémentaire). La jonction peut être accomplie en quelques heures, avec une réaction de l'étape 1 de 1 h décrite dans les méthodes, suivie d'un nettoyage de l'ADN pour éliminer les courtes coupures d'extrémité d'ADN. D'après notre expérience, une telle ligature linéaire permet de joindre l'ADNdb linéaire avec une efficacité de près de 100 %, les pertes étant principalement dues au nettoyage à l'aide d'un kit de colonne de centrifugation. Cette étape préliminaire peut ensuite être suivie d'une circularisation à l'aide du protocole Circular Vector, ce qui permet à l'ensemble du processus d'être achevé plusieurs fois plus rapidement que les nombreuses étapes du clonage bactérien. De plus, dans les cas où un vecteur circulaire à une seule unité pure est requis, il peut être extrait par électrophorèse sur gel.

Un autre avantage important de cette méthode est son faible coût. Notre exemple de calcul des coûts dans la section Réactifs, matériaux et coûts montre que le coût fixe du fragment d'ADNdb linéaire commandé auprès d'un fournisseur commercial est de 32,90 $ pour un vecteur circulaire de 452 bp. La réaction ne coûte que 9,30 $. Si une amplification PCR est nécessaire, cela ajoute 4,76 $ au total et élimine le besoin de commander à nouveau les fragments d'ADNdb d'entrée auprès d'un fournisseur. Le protocole produit 2,0 à 2,5 μg de vecteur circulaire, ce qui est suffisant pour plus de 10 modifications sur une plaque à 24 puits (sur la base des quantités que nous avons utilisées dans la section Protocole étape par étape) et ~ 40 modifications sur une plaque à 96 puits. Cela se compare favorablement au clonage bactérien, où le coût total de la conception à un plasmide prêt pour la transfection est généralement plusieurs fois plus élevé (en plus d'un temps pratique et global beaucoup plus long). Il est encore plus cher de commander des plasmides prêts à l'emploi, comme présenté dans la note complémentaire 5 sur l'exemple de tarification de deux fabricants sous contrat, et encore plus cher de commander des epegRNA préfabriqués.

Dans cette recherche, nous avons présenté une méthode et un protocole de circularisation pour la préparation de vecteurs circulaires qui peuvent être utilisés dans une variété d'applications nécessitant l'expression d'ARN courts et de protéines. Pour une longueur de vecteur circulaire de 450 pb, l'efficacité de conversion de l'ADN d'entrée en vecteurs circulaires était de 48 % à 1 h de ligature et jusqu'à 62 % à 12 h de ligature. Pour une longueur de 950 pb, cette efficacité était de 26 % à 1 h de ligation et de 30 % à 12 h de ligation, avec des valeurs intermédiaires pour les vecteurs circulaires entre 450 et 950 pb de longueur. Des temps de réaction plus longs correspondaient à une certaine amélioration du rendement du vecteur circulaire. Cependant, une courte étape de ligature de 1 h a l'avantage d'un traitement rapide et efficace de 3 h du début à la fin.

Comme preuve du principe, nous avons appliqué un vecteur circulaire exprimant l'epegRNA dans la culture cellulaire, et démontré la correspondance et le dépassement des performances de cette méthode par rapport à la livraison de plasmide rapportée par Chen et al.15. Sa rapidité, son faible coût et sa facilité d'utilisation feront de cette méthode un autre outil précieux dans la boîte à outils d'édition de gènes, tandis que la simplicité de la réaction rend le protocole adapté aux systèmes automatisés de manipulation de liquides37.

Avec cette méthode, qui consiste en une réaction en deux étapes à tube unique suivie d'un nettoyage typique de l'ADN basé sur une colonne de centrifugation, un chercheur peut produire un lot de vecteurs circulaires en 3 h. La méthode du vecteur circulaire simplifie la fabrication de petits composants de ciblage variables qui fonctionnent en conjonction avec un grand plasmide invariable codant pour Cas9 et/ou d'autres protéines et gènes. Ce grand plasmide peut être cloné en grande quantité en culture bactérienne, extrait avec l'une des maxi-preps disponibles dans le commerce, et utilisé pour les mois voire les années d'expériences suivantes. Notamment, la composante variable de chaque cible d'édition, le vecteur circulaire, est désormais un jeu d'enfant à créer.

L'ADN circularisé est résistant à la dégradation par les exonucléases dans le cytoplasme14. L'ADN linéaire manque d'une telle stabilité, ce qui constitue un obstacle important à son utilisation pour la délivrance de gènes. De plus, notre méthode tire parti de cette différence de propriétés en utilisant l'exonucléase T5 pour digérer des fragments d'ADN linéaire n'ayant pas réagi ou ayant mal réagi, purifiant ainsi l'ADN du vecteur circulaire.

Notre méthode de circularisation pour les vecteurs d'expression du guide CRISPR nécessite une conception initiale de séquence d'ADN, qui peut être créée à l'aide des outils préférés du chercheur (nous avons utilisé SnapGene 6.0.7), suivie de la commande de fragments d'ADNdb auprès d'un fabricant commercial.

L'ADNdb préfabriqué doit au minimum contenir un promoteur (U6, dans notre exemple), suivi d'un segment d'ADN codant pour l'epegRNA avec un terminateur38 (voir Fig. 1a et la carte détaillée dans la Fig. 1 supplémentaire). L'epegRNA peut être conçu à l'aide d'un outil publié adapté à cet effet15,16,39. Deux sites de reconnaissance d'enzymes de restriction de type IIS correspondants créent des surplombs complémentaires de 4 nt près des deux extrémités du fragment d'ADNdb. Le vecteur circulaire peut être facilement validé avec le séquençage Sanger (voir Fig. 1b). Placer deux amorces, Sanger-1 et Sanger-2, près des emplacements opposés de la structure circulaire s'est avéré efficace et fiable, couvrant la majeure partie de la structure circulaire avec le chevauchement qui inclut l'amorce opposée près du milieu de la séquence FASTA. Si le séquençage du plasmide entier est préféré, les entreprises effectuant un tel séquençage - par exemple, Plasmidsaurus (www.plasmidsaurus.com) - ont besoin d'un cercle minimum de 2000 bp, cependant les techniques basées sur l'amplification en cercle roulant, comme celle développée par Octant40, peuvent être en mesure de séquencer l'ADNdb circulaire court.

Les surplombs correspondants créés par les coupes d'enzymes de restriction sont conçus pour fournir une ligature haute fidélité41, qui est également aidée par l'absence de tout autre surplomb qui serait présent dans un assemblage Golden Gate typique (voir Fig. 1c). Les séquences « nnnnnn » sur la figure 1c représentent le minimum de six paires de bases requises sur l'extrémité arrière de l'enzyme de restriction. Certains fabricants (par exemple, Twist Bioscience) préfèrent délivrer leurs fragments d'ADN avec des adaptateurs terminaux qui servent d'amorces d'amplification PCR bien conçues et éliminent simultanément le besoin d'incorporer des séquences terminales.

Notre objectif était de rendre la méthode de production de vecteurs circulaires conviviale et rapide. Ainsi, nous avons principalement utilisé des enzymes de réaction et des tampons basés sur des kits commerciaux, avec seulement quelques réactifs supplémentaires. Si désiré, les kits peuvent être remplacés par des réactifs individuels. Si une quantité suffisante d'ADNdb est reçue d'un fabricant commercial, elle peut être utilisée directement dans la réaction ; sinon, il peut être nécessaire de l'amplifier par PCR pour obtenir la quantité souhaitée. Le protocole de préparation des vecteurs ADN circularisés comprend trois étapes :

Étape 1 : Circularisation de l'ADN source (Fig. 1d). Mélanger les réactifs de réaction énumérés dans le tableau 2 par pipetage, de préférence sur de la glace, dans un tube PCR de 200 ul ou un autre tube approprié avec au moins le double du volume de réaction du tableau 2. Le volume supplémentaire sera nécessaire pour l'ajout des réactifs de digestion à l'étape 2. Placer le tube dans un thermocycleur et exécuter la réaction comme décrit dans le programme du cycleur du tableau 2.

Étape 2 : Digestion de tout l'ADN linéaire restant (Fig. 1e). Préparez le mélange réactionnel d'exonucléase T5 comme indiqué dans le tableau 3 et mélangez-le en proportion 1: 1 dans le tube contenant le mélange réactionnel de l'étape précédente. Par exemple, si une réaction de 50 ul a été effectuée à l'étape 1, 50 ul devront être ajoutés. Programmez et exécutez le thermocycleur comme indiqué dans le programme du cycleur du Tableau 3.

Étape 3 : Nettoyage de l'ADN circularisé (Fig. 1f). Utilisez un kit de colonne de centrifugation tel que le kit de purification QIAquick PCR ou votre méthode préférée.

Les étapes du protocole ci-dessus sont suffisantes pour une application pratique de la méthode. Pour une explication détaillée des étapes et du raisonnement qui les sous-tend, lisez la section suivante.

La digestion par l'enzyme de restriction et la réaction de ligature sont suivies de 15 min d'inactivation par la chaleur pour mettre fin à la réaction de ligature (voir Fig. 1D). La température de réaction constante de 37 oC a été choisie pour minimiser la ligature des mésappariements42,43. L'ADN ligase T4 s'inactive à 65 oC. Étant donné que l'enzyme de restriction a été choisie avec une température d'inactivation plus élevée, l'enzyme de restriction restera active et facilitera légèrement l'étape de digestion suivante. Les concentrations de ligase et d'enzyme de restriction ont été expérimentalement déterminées pour mieux fonctionner avec une concentration légèrement plus élevée que ce qui est typique dans l'assemblage Golden Gate. Cette concentration plus élevée sert à deux fins : elle facilite un traitement rapide et, plus important encore, l'enzyme de restriction coupe rapidement les surplombs libres aux deux extrémités d'un fragment d'ADN, permettant ainsi l'auto-ligature de ces surplombs sur le même fragment d'ADN et limitant la proportion de plusieurs fragments d'ADN se ligaturant les uns sur les autres (voir la discussion plus approfondie dans la section Résultats). Les concentrations d'ADNdb linéaire d'entrée ont été testées dans une plage de 7, 5 à 120 ng / μl et ont produit un rendement et une composition d'ADN circularisé indiscernables. Une concentration de 120 ng/μl entraîne l'apport de 6,0 μg d'ADN par réaction de 50 μl, ce qui a été considéré comme optimal du point de vue de la manipulation et du coût des réactifs. L'ajout d'ATP peut être facultatif pour une durée de ligature de 1 h, avec des concentrations croissantes d'ATP de 1 mM fournies par le tampon NEB T4 ADN ligase à 2 mM montrant une légère amélioration du rendement, en particulier à des durées de ligature plus longues. Cela peut être dû à l'épuisement de l'ATP avec une concentration élevée d'ADN ligaturé, ainsi qu'à l'inactivation de l'ATP à des durées de réaction plus longues. La concentration d'ATP de 2 mM se situe bien dans la plage optimale pour les mélanges d'ADN ligase T444, et le réactif ATP est peu coûteux. La substitution de l'enzyme de restriction par une enzyme de type IIS différente peut être nécessaire dans les cas où la séquence codant pour l'epegRNA comprend le site de reconnaissance BsaI (pour un exemple d'utilisation de BbsI dans un scénario légèrement différent, voir Fig. 2 supplémentaire).

Digestion d'ADN non circularisé (Fig. 1e). Cette étape consiste à ajouter une quantité égale de réactifs d'exonucléase d'ADN T5 à la réaction de ligation. Par exemple, 50 μl de mélange réactionnel d'exonucléase sont ajoutés à 50 μl de sortie de réaction de ligature, ce qui donne un niveau confortable de 100 μl de mélange réactionnel dans un thermocycleur à tube PCR Eppendorf typique de 200 μl (des tubes plus grands et des bains secs, etc. peuvent être utilisés si désiré). La concentration d'exonucléase d'ADN T5 a été validée comme suffisante pour digérer complètement tout l'ADN linéaire en moins d'une heure pour toutes les longueurs d'ADN d'entrée testées dans cette recherche. Nous avons constaté que l'ajout uniquement de l'exonucléase T5 à la réaction de ligature entraînait une vitesse de digestion très lente en raison de l'absence d'ions potassium. Le rôle de NEBuffer 4 est de fournir des anions potassium qui accélèrent les réactions d'exonucléase. Alors que la concentration de potassium dans le mélange résultant est la moitié de celle du mélange réactionnel exclusivement NEBuffer 4, elle reste proche de la concentration optimale pour les réactions de clivage45. L'équilibre optimal entre l'activité de l'exonucléase et de l'endonucléase pour l'exonucléase T5 se situe au pH de réaction de 7,9 à 8,046. Il s'agit du pH de NEBuffer 4, tandis que le pH du tampon de ligation est de 7,5. Ainsi, une quantité appropriée de base Tris a été ajoutée pour augmenter le pH dans cette plage, comme présenté dans le tableau 2 (article principal). Notamment, il n'est pas recommandé d'augmenter excessivement le pH pour le mélange réactionnel de l'exonucléase T5. Lorsque nous avons testé des augmentations de pH au-dessus de 8,5, tout l'ADN, y compris l'ADN circularisé, a été complètement et rapidement digéré.

Nettoyage de l'ADN circularisé. Cette étape consiste à utiliser un kit de nettoyage d'ADN de qualité pour extraire l'ADN du vecteur circulaire d'une concentration et d'une pureté suffisantes. Nous avons utilisé un kit de colonne de centrifugation, qui a été sélectionné comme décrit ci-dessous. Avec un grand nombre de ces produits disponibles, le choix du kit dépend de la préférence du chercheur ; cependant, le rendement peut varier. Notre objectif était de sélectionner un kit d'extraction simple basé sur une colonne de spin qui fournirait un rendement constamment élevé, un faible niveau d'impuretés et une concentration d'ADN suffisamment élevée pour des mesures précises et cohérentes. Cette pureté était importante pour l'utilisation directe des vecteurs circulaires dans la transfection de culture cellulaire et pour la précision des mesures de concentration et de rendement rapportées par cette étude. Un certain nombre de kits ont été examinés, et trois kits ont ensuite été testés et évalués pour leur efficacité dans l'extraction de l'ADN et la faible contamination saline chaotropique : le Takara Bio NucleoSpin Gel and PCR Cleanup 740609.5047, le QIAGEN QIAquick PCR Purification Kit 2810648 et le NEB Monarch PCR & DNA Cleanup Kit T1030S49.

Sur la base d'un test de validation avec le même ensemble de produits PCR, le kit QIAquick a été choisi en raison de sa meilleure récupération de l'ADN d'entrée vers la sortie par rapport aux deux autres kits (20 % de mieux que NucleoSpin et 30 % de mieux que NEB) et présentant une faible quantité de sels chaotropiques capturés lors du test d'un nettoyage de produit PCR vierge sans aucun apport d'ADN. De plus, même si le kit QIAquick évalue 30 μl comme volume d'élution minimal, il fonctionne avec un bon compromis de rendement et des concentrations d'ADN plus élevées et montre une excellente pureté lors de l'élution avec des volumes inférieurs à 20 μl, ce qui était préférable pour nos expériences de validation d'édition principale. Le kit de purification QIAquick PCR s'est avéré très fiable et cohérent, avec une seule valeur aberrante qui avait environ la moitié du rendement observé dans l'ensemble des expériences. Ce résultat aberrant peut être dû à un défaut dans la colonne de spin ; ainsi, l'échantillon a été jeté.

Le kit QIAquick comprend un indicateur de pH optionnel qu'il est recommandé d'ajouter au tampon de liaison en raison de son importance pour maximiser le rendement en ADN. Le réactif indicateur nous permet de vérifier si le pH du mélange est optimal pour la liaison. Notamment, nous avons déterminé qu'un ajustement du pH était nécessaire via l'ajout d'un ou plusieurs 10 μl d'acétate de sodium 3M pH = 5,2, comme recommandé par QIAGEN48.

Une attention particulière a été accordée à la minimisation des pertes de pipetage. La quantité d'ADN d'entrée a été ajustée pour donner un ADN de produit de sortie dans la plage de 2 à 4 μg, ce qui a fourni une quantité suffisante du produit d'ADN final pour la mesure et le test. Dans les cas extrêmes, la quantité d'ADNdb d'entrée pour le vecteur circulaire de 1782 pb devait être augmentée jusqu'à 27 μg, ce qui n'entraînait toujours qu'un rendement de 1,3 à 1,7 μg, tandis qu'une quantité d'ADN d'entrée de 6 à 9 μg était suffisante dans la plage de 450 à 950 pb. Un rendement aussi faible, qui nécessiterait un apport élevé en ADN et l'utilisation de grandes quantités de réactifs pour produire un produit suffisant, indique que de longs vecteurs circulaires ne sont pas pratiques à synthétiser. Nous avons de préférence visé à atteindre une concentration d'ADN de sortie bien supérieure à 80 ng/μl, ce qui se traduirait par un ADN de haute pureté basé sur des rapports de 260/230 et 260/280. Cela a en outre été facilité par la réalisation d'une étape de lavage supplémentaire lors de l'utilisation des kits de purification, ce qui a entraîné une sortie d'ADN toujours pure avec un sacrifice potentiel minimal en termes de rendement. Les mesures de concentration d'ADN ont été principalement effectuées sur un spectrophotomètre NanoDrop Eight (ThermoFisher Scientific) et répétées sur un spectrophotomètre/fluoromètre de la série DS-11 (DeNovix). Notamment, les concentrations mesurées étaient étroitement appariées entre ces deux dispositifs.

L'extraction de la bande 1 pour tester les performances d'édition de gènes du vecteur circulaire unique pur sans doublons a été réalisée par séparation de l'ADN par électrophorèse sur des gels d'agarose E-Gel EX à 1 % (Invitrogen). L'ADN du vecteur circulaire a été nettoyé à l'aide du kit d'extraction de gel d'ADN Monarch (T1020S) avec une étape de lavage supplémentaire.

Le rapport de rendement maximal possible de la réaction de circularisation est calculé en divisant la longueur de l'ADN circularisé, tel que déterminé par les sites de coupure de l'enzyme de restriction en fonction de la longueur de l'ADNdb d'entrée. En règle générale, une enzyme de restriction de type IIS nécessite six paires de bases ou plus entre elle et l'extrémité du brin d'ADNdb pour assurer une coupe efficace. Le site de reconnaissance de l'enzyme de restriction lui-même, un décalage entre le site de reconnaissance et l'emplacement de la coupe et une longueur du surplomb sont également rejetés. Pour notre manipulation, il était pratique de conserver les adaptateurs d'extrémité Twist Bioscience, qui ont une longueur de 22 pb et peuvent être utilisés avec les amorces Twist Bioscience pour l'amplification par PCR de ces fragments d'ADN. Dans ce cas, le dénominateur du rapport de rendement maximal possible est la longueur de l'ADNdb commandé auprès de Twist Bioscience plus 44 pb. Tous les éléments peuvent être formellement représentés par l'équation suivante :

où R est le rapport de rendement maximal, Lc est la longueur de l'ADN circularisé, Lenz_site est le site de l'enzyme de reconnaissance, Lenz_offset est le décalage entre le site de reconnaissance de l'enzyme et le début de la coupe, Lcut_length est la longueur de la coupe (généralement 4 bp), et Lend_pad est soit un rembourrage, soit des adaptateurs d'extrémité (comme dans notre cas), en supposant qu'ils sont de longueur égale à chaque extrémité. Par exemple, pour l'ADNdb fourni par Twist Bioscience avec des adaptateurs pour créer un vecteur circulaire de 452 bp, le rapport de rendement maximal possible est de 0,88. Ainsi, si 6 μg d'ADN sont utilisés comme intrant, le rendement maximal possible sera de 6 * 0,88 = 5,28 μg.

Nous définissons le multiplicateur molaire du produit de réaction de circularisation comme le rapport du poids relatif combiné produit par circularisation à la fraction molaire relative d'un seul guide circulaire. Nous évaluons les luminosités relatives des bandes à partir de l'image d'électrophorèse sur gel, qui a été traitée à l'aide de ImageJ du NIH (voir la Fig. 3 supplémentaire pour l'ensemble complet d'images d'électrophorèse sur gel non modifiées). Puisque nous connaissons la luminosité relative, nous devons additionner toutes les luminosités relatives des bandes, qui, par définition, seront = 1 divisé par la somme de la luminosité relative de chaque bande (Ii) divisée par le nombre i de cette bande. Ainsi, le multiplicateur molaire M est calculé comme suit :

Les cellules HEK293T ont été ensemencées sur des plaques 24 puits (Corning) à raison de 140 ⋅ 103 cellules par puits dans du DMEM additionné de 10 % de FBS. Environ 24 h après l'ensemencement, les cellules ont été transfectées à 60 % de confluence avec 2,0 mL de Lipofectamine 2000 dans Optimem (Thermo Fisher Scientific) selon le protocole du fabricant et 800 ng de plasmide Cas9 prime editor, avec des rapports molaires de 4:1 (110 ng pour les vecteurs circulaires purifiés à bande unique de 452 pb, 175 ng pour un vecteur circulaire de 452 pb et 37 0 ng pour un vecteur circulaire de 952 pb) pour chacun des guides de localisation (HBB, CDKL5 et substitution de base unique PRNP basée sur15).

Ensuite, 14 à 16 h après la transfection, le milieu a été remplacé par du DMEM frais plus 10 % de FBS et 6 ng/μl de blasticidine (Thermo Fisher Scientific) pour sélectionner les cellules contenant l'éditeur principal. Cela a été suivi 24 h plus tard par 6 ng/μl. Ensuite, un changement de milieu a été effectué après 24 h (sur la base d'une recommandation de Xiong et al.50). L'ADN génomique a été extrait 72 h plus tard à l'aide d'un kit Zymo Research Quick-DNA Microprep (D3020).

Les zones génomiques d'intérêt ont été amplifiées à partir de 4 ng d'ADN du génome entier à l'aide de Q5 High-Fidelity 2 × Master Mix (New England BioLabs) à 24-26 cycles en utilisant le protocole de mélange maître (voir les fichiers de données de disponibilité des données pour une liste des amorces). Cela a été suivi d'une séparation de l'ADN par électrophorèse sur des gels d'agarose E-Gel EX à 1 % (Invitrogen) et de l'utilisation d'un kit d'extraction de gel d'ADN Monarch (T1020S) avec une étape de lavage supplémentaire. Le séquençage Sanger a été réalisé par Azenta Genewiz en utilisant nos amorces PCR.

Le faible coût des réactifs du protocole est illustré ici par la répartition d'une réaction typique de 50 ul. Les réactifs sont utilisés dans les quantités indiquées dans le tableau 2 et le tableau 3. Les sources et les identificateurs du fabricant sont fournis dans le tableau 4. La majeure partie des dépenses inhérentes aux vecteurs circulaires est le coût de l'ADNdb linéaire commandé auprès d'un fournisseur commercial. Nous présenterons les coûts pour l'exemple de notre vecteur circulaire de 452 bp. Les prix que nous avons payés pour les réactifs étaient typiques des acheteurs universitaires au détail, sans aucune remise supplémentaire. Avec une longueur circularisée de 452 pb, un fragment d'ADNdb de 470 pb a été commandé auprès de Twist Bioscience au prix catalogue de 0,07 $ par paire de bases, ce qui a entraîné un coût d'entrée d'ADN de 32,90 $.

Habituellement, 1,5 à 2,0 μg de fragment d'ADNdb ont été délivrés par Twist Bioscience. Les coûts des réactifs pour un protocole de 50 ul sont présentés dans le tableau supplémentaire 1, en quantités répertoriées dans la section Protocole étape par étape. La sortie prévue est de 2,0 à 2,5 μg de vecteur circulaire, ce qui nécessite une entrée de 6,0 μg d'ADNdb. Un tel rendement est suffisant pour plus de 10 modifications sur une plaque de 24 puits et ~ 40 modifications sur une plaque de 96 puits. Le coût de ce protocole de vecteur circulaire est de 9,30 $. Si votre fournisseur peut livrer une quantité suffisante de fragments d'ADN, c'est à vos frais.

Dans notre étude, nous avons dû exécuter une étape d'amplification par PCR (facultative, tarifée dans le tableau supplémentaire 1), ce qui a ajouté 4,76 $ au coût. Si seule une petite quantité de vecteurs circulaires est nécessaire, la réaction peut être réduite à une plus petite quantité d'ADN disponible, avec une utilisation moindre de réactifs et un coût résultant inférieur.

Toutes les réactions du protocole ont été réalisées en doubles de réaction indépendants (n = 2) ou en triples (n = 3), comme indiqué, et les valeurs de pourcentage de rendement ont été moyennées. L'électrophorèse sur gel des échantillons ci-dessus a été analysée à l'aide du logiciel ImageJ des National Institutes of Health17 dans des échantillons en double indépendants (n = 2), et les valeurs de pourcentage de concatémère résultantes ont été moyennées.

L'analyse de l'efficacité de l'édition effectuée à partir du séquençage Sanger en utilisant EditR22,23 à partir d'échantillons indépendants en triple (n = 3) ou en quadruple (n = 4). Les valeurs P pour l'efficacité de l'édition calculées par EditR étaient P < 5 ⋅ 10−8 pour tous les échantillons. Les valeurs d'efficacité d'édition ont été moyennées et les valeurs d'écart type correspondantes présentées dans le tableau 1.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données sources sont fournies avec cet article Données supplémentaires 1. Les données de séquençage de Sanger ont été déposées dans la base de données GenBank sous les numéros d'accès commençant par OP971846 et se terminant par OP971880. Les images de gel non recadrées sont présentées dans la Fig. 3 supplémentaire.

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Département de génétique, Harvard Medical School, Boston, MA, États-Unis

Église romaine Theo Olynyk et George M.

Département d'informatique, Université d'Auckland, Auckland, Nouvelle-Zélande

Roman Teo Olynyk

Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering à l'Université Harvard, Boston, MA, États-Unis

Église George M.

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RO a conçu et effectué des recherches ; RO et GC ont analysé les données et rédigé l'article.

Correspondance avec Roman Theo Oliynyk.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Valentin Zulkower et le(s) autre(s) relecteur(s) anonyme(s) pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef de la manipulation principale : Cesar de la Fuente et Eve Rogers. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

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Réimpressions et autorisations

Oliynyk, RT, Church, GM Modification et préparation efficaces d'ADN circulaire pour l'expression en culture cellulaire. Commun Biol 5, 1393 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04363-z

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Reçu : 15 août 2022

Accepté : 09 décembre 2022

Publié: 21 décembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-022-04363-z

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