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Jan 02, 2024

SRAS

Volume Biologie des communications

Communications Biology volume 5, Article number: 1170 (2022) Citer cet article

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La glycoprotéine de pointe trimérique (S), qui dépasse de l'enveloppe virale du SRAS-CoV-2, se lie à l'ACE2 humain, initiée par au moins un domaine de liaison au récepteur d'un protomère (RBD) passant d'un état "bas" (fermé) à un état "haut" (ouvert). Ici, nous avons utilisé des simulations de dynamique moléculaire à grande échelle et des calculs d'échantillonnage de parapluie d'échange de répliques bidimensionnelles avec plus d'un millier de fenêtres et un total agrégé de 160 μs de simulation pour étudier cette transition avec et sans glycanes. Nous constatons que la pointe glycosylée a une barrière plus élevée à l'ouverture et favorise également énergétiquement l'état bas par rapport à l'état haut. L'analyse de la voie d'ouverture de la protéine S révèle que les glycanes à N165 et N122 interfèrent avec les liaisons hydrogène entre le RBD et le domaine N-terminal à l'état haut, tandis que les glycanes à N165 et N343 peuvent stabiliser les états bas et haut. Enfin, nous estimons comment l'exposition à l'épitope pour plusieurs anticorps connus change le long du chemin d'ouverture. Nous constatons que l'épitope de l'anticorps BD-368-2 est continuellement exposé, expliquant sa grande efficacité.

La pandémie de COVID-19 causée par le coronavirus SARS-CoV-2 s'est rapidement propagée dans le monde entier avec un impact néfaste sans précédent sur la santé et les économies mondiales1. Le développement rapide de plusieurs vaccins2, traitements par anticorps monoclonaux3 et thérapeutiques4 a atténué l'épidémie virale actuelle. Cependant, la menace continue des variantes, y compris les sous-lignées Omicron désormais dominantes5, et la possibilité de futures épidémies de coronavirus6 nécessitent une compréhension approfondie du cycle de vie viral, y compris la reconnaissance, la liaison, l'infection et la réponse immunitaire.

L'infection par le SRAS-CoV-2 est initiée par la reconnaissance et la liaison au récepteur de l'enzyme de conversion de l'angiotensine 2 (ACE2) de la cellule hôte7,8. Ce processus est médié par la protéine SARS-CoV-2 spike (S), une glycoprotéine de fusion homotrimère de classe I qui dépasse de la surface du virion SARS-CoV-2. La libération de la séquence de la protéine S au début de 2020, combinée à des travaux structurels antérieurs sur des bétacoronavirus apparentés, a conduit à la détermination rapide des structures des constructions d'ectodomaine de la protéine S solubilisées et stabilisées avant la fusion9,10,11 ainsi que des pointes pleine longueur12 et des virions intacts13. Chaque protomère est constitué des sous-unités S1 et S2 séparées par un site de clivage multibasique de la furine. S1 contient le domaine de liaison au récepteur (RBD) et assure la reconnaissance de la cellule hôte tandis que S2 consiste en la machinerie de fusion membranaire nécessaire à l'entrée virale7. La protéine S est une cible antigénique majeure avec plusieurs épitopes ciblés par le système immunitaire humain, y compris le RBD et le domaine N-terminal (NTD)14,15,16,17. Il est également suggéré que le RBD recombinant soit un inhibiteur d'entrée potentiel contre le SRAS-CoV-218. De plus, la glycosylation de la protéine S aide à masquer et à protéger le virus de la réponse du système immunitaire de l'hôte19,20,21. La protéine S est caractérisée par des états conformationnels bas et haut, qui s'interconvertissent de manière transitoire via un mouvement de type charnière exposant le motif de liaison au récepteur (RBM), qui est composé des résidus RBD S438 à Q50622. Le RBM est enfoui dans l'interface inter-protomère de la protéine down S ; par conséquent, la liaison à ACE2 repose sur l'interconversion stochastique entre les états bas et haut.

Des études de cryo-microscopie électronique (cryo-EM) ont révélé des informations structurelles détaillées pour les états conformationnels haut et bas23. Cependant, relativement peu d'études ont exploré la dynamique de ces états haut/bas et l'interconversion entre eux. Par exemple, le FRET à molécule unique a été utilisé pour démontrer la nature stochastique des transitions de la protéine S24, avec des échelles de temps rapportées de l'ordre de la milliseconde à la seconde. Il convient de noter que des études ultérieures de FRET sur une seule molécule ont révélé une cinétique de transition descendante altérée pour les protéines de pointe mutantes25. Les simulations de dynamique moléculaire (MD) complètent ces études expérimentales en fournissant les descriptions au niveau atomique des états intermédiaires entre le bas et le haut qui sont nécessaires pour caractériser la dynamique d'ouverture de la protéine S. Les simulations MD ont révélé des informations détaillées sur la stabilité structurelle et le rôle de la glycosylation pour les états bas et haut, ainsi que pour les interactions inter-résidus et les détails de la liaison à ACE220,21,26,27,28,29. Des voies d'ouverture déterminées à l'aide de MD dirigé et de MD ciblé ont été rapportées29,30,31. De plus, des simulations approfondies utilisant des techniques d'échantillonnage améliorées telles que l'échantillonnage adaptatif d'ensemble pondéré32 et d'amplification de fluctuation de traits spécifiques (FAST) combiné à Folding@home33 ont fourni des détails sur les multiples voies d'ouverture de la protéine S. De plus, les caractéristiques du paysage énergétique de ces transitions conformationnelles nécessaires à la liaison et à l'entrée virales commencent à émerger27,30,31,34, y compris la combinaison de données cryo-EM avec des simulations MD pour révéler plusieurs sous-populations pour les états bas et haut35,36.

Une étude récente d'Amaro et de ses collègues a mis en évidence le rôle fonctionnel des glycanes à N165 et N234 au-delà du blindage26 sur la base de simulations d'équilibre séparées des états bas et haut de la protéine S. Lorsque le RBD passe à l'état haut, le glycane à N234 tourne dans le vide résultant, stabilisant la conformation haute. De plus, les simulations de MD et la mutagenèse ont révélé les contributions du glycane à N343 à la dynamique de l'ouverture du RBD et de la liaison à l'ACE232. Ces résultats ont proposé un rôle pour le glycan à N343 dans la transition conformationnelle d'ouverture par l'intermédiaire « de levage » le RBD par des interactions séquentielles avec les résidus multiples de RBD, désignés sous le nom « de déclenchement de glycan ».

Ici, nous décrivons des paysages d'énergie libre bidimensionnels (2D) nouvellement déterminés des transitions d'ouverture et de fermeture de la protéine S du SRAS-CoV-2 à l'aide de simulations d'échantillonnage de parapluie d'échange de répliques (REUS) exécutées sur le supercalculateur pré-exascale Summit à Oak Ridge National Lab (ORNL) pour la protéine S glycosylée et non glycosylée. Nous mettons en évidence l'impact des glycanes sur chaque état et sur la cinétique d'ouverture des pointes. En outre, nous avons analysé l'exposition d'épitopes proéminents sur la surface de la protéine S et fourni une image dynamique de la liaison des anticorps le long du chemin d'ouverture des pointes. Enfin, nous rapportons les résultats de simulations MD à l'équilibre des systèmes glycosylés et non glycosylés pour les états conformationnels vers le bas et vers le haut afin de mieux caractériser le rôle stabilisateur des glycanes.

À l'aide de simulations REUS, nous avons étudié le changement d'énergie libre de l'état bas de la pointe à l'état haut lorsqu'il est entièrement glycosylé ainsi que lorsqu'il n'est pas glycosylé. Nous avons modélisé l'état de type sauvage (WT) sur la base de la structure mutante diproline de Walls et al.10 (PDB : 6VYB). L'état bas a été modélisé à l'aide d'une structure plus récente de Cai et al.12 (PDB : 6XR8) sans les mutations de la diproline. Le glycane avec la population la plus élevée dans les données de spectroscopie de masse de Crispin et ses collègues19 sur chaque site a été ajouté à l'aide du serveur Web GLYCAM développé par le groupe Woods (http://glycam.org)37,38. Ces modèles sont illustrés sur les Fig. 1a, b avec des détails supplémentaires sur les systèmes fournis dans Méthodes.

a La protéine trimérique S à l'état all-down, colorée par le protomère. Les glycanes sont représentés par des sphères rouges. b Vue de dessus de la protéine S à l'état unique. Des domaines importants de la pointe sont mis en évidence, notamment le domaine N-terminal (NTD, 14–306), les domaines de liaison aux récepteurs (RBD, 336–518), l'heptade répétée 1 (HR1, 908–986) et l'hélice centrale (CH, 987–1035). c, d Les deux variables collectives définies pour décrire l'ouverture de RBD-A incluent : c la distance du centre de masse d entre RBD-A (336–518, rose) et SD1-B (531–592, citron vert), et d l'angle dièdre ϕ formé par le centre de masse des domaines RBD-A (336–518, rose), SD1-A (531–592, violet), SD2-A (593–6 77, bleu glacier) et NTD-A (27–307, cyan). RBD-A dans les états bas (rose uni) et haut (rose transparent) sont affichés.

Nous avons d'abord exécuté des simulations métadynamiques des structures cryo-EM dans les états bas et haut, leur permettant d'explorer l'espace conformationnel qui les entoure et de connecter les deux structures. L'espace conformationnel est décrit par deux variables collectives, qui sont (1) la distance du centre de masse (d) entre l'ouverture RBD-A et une partie stationnaire de la pointe agissant comme un point pivot, à savoir le sous-domaine voisin 2 sur la chaîne B (SD2-B), et (2) l'angle dièdre (ϕ) formé par les centres de masse de l'ouverture RBD-A et d'autres domaines stationnaires sur le même protomère, à savoir SD2-A, SD1-A et NTD-A (Fig. 1c, d). Les domaines stationnaires ont été vérifiés pour avoir une dynamique minimale par rapport à l'amplitude de mouvement de RBD-A (tableau S1). Des instantanés ont ensuite été extraits des simulations métadynamiques pour ensemencer les simulations REUS, qui ont été exécutées avec les deux mêmes variables collectives. Pour le système glycosylé, nous avons en outre effectué un recuit simulé sur les glycanes pour randomiser leurs conformations dans chaque fenêtre. Une série de simulations REUS ont été exécutées pour explorer plus avant différentes régions de l'espace d-ϕ, en utilisant jusqu'à 1049 et 1211 fenêtres (tableau S2), et un temps de simulation total de 65 μs et 91 μs pour les systèmes glycosylés et non glycosylés, respectivement.

Pour le système glycosylé, les conformations des deux structures cryo-EM sont apparues comme des minima d'énergie sur le potentiel 2D de force moyenne (PMF) comme prévu (Fig. 2a). Entre les deux conformations stables, l'état haut possède une énergie supérieure à l'état bas de 5,2 ± 0,1 kcal/mol (Figs. 2c, S1a). Cette découverte est cohérente avec de multiples études informatiques utilisant diverses méthodes d'échantillonnage améliorées, qui ont également conclu que l'état bas est la conformation la plus probable33,34,39,40. Les différences entre les deux puits d'énergie à l'état final ne s'arrêtent pas à leur profondeur mais aussi à leur largeur. Si nous mesurons la largeur des puits d'énergie le long de d à 2,5 kcal / mol au-dessus de leurs minima d'énergie, le puits d'énergie à l'état bas s'étend de d = 43,1 Å à 48,9 Å, tandis que le puits d'énergie à l'état supérieur couvre d = 60,1 Å à 75,6 Å, ce qui fait que ce dernier est 2,7 fois plus large que le premier. Des travaux récents de Zimmerman et al.33 et Sztain et al.32 trouvent également que le RBD est très flexible à l'état haut, permettant une large gamme de structures à l'état haut qui s'ouvrent plus largement que la structure cryo-EM. Notre PMF permet maintenant d'estimer la probabilité d'observer des structures aussi largement ouvertes. Nous avons également calculé le chemin d'énergie minimum (MEP)41,42 reliant les états bas et haut (Fig. 2a, Film supplémentaire 1). Le chemin est principalement diagonal sur le PMF 2D, à l'exception d'une forte augmentation de ϕ lors de la sortie du puits d'énergie à l'état bas et d'une légère diminution de ϕ à l'entrée du puits d'énergie à l'état supérieur. La barrière énergétique séparant les deux conformations stables a une hauteur de 11,0 ± 0,1 kcal/mol et se situe à d = 55,6 Å.

a, b Les PMF 2D des systèmes a glycosylé et b non glycosylé le long de deux variables collectives, d et ϕ, définies pour décrire l'ouverture de RBD-A (Fig. 1c, d). L'emplacement des structures cryo-EM vers le bas (6XR8) et vers le haut (6VYB) est indiqué par un signe "+" et "x", respectivement. La ligne pointillée noire montre le MEP pour chaque système. c Les énergies libres sont projetées sur d et tracées sous forme de PMF 1D. Voir également Données supplémentaires 1.

Le PMF pour le système non glycosylé est qualitativement similaire mais significativement différent quantitativement du système glycosylé (Fig. 2b). Sans les glycanes, la différence d'énergie entre les états bas et haut devient étonnamment petite et tombe en dessous de l'erreur statistique (Figs. 2c, S1b). Le rapport de largeur le long de d entre les puits d'énergie à l'état bas et à l'état haut reste à 2,7, le même que le système glycosylé, avec le puits à l'état bas s'étendant de d = 43,6 Å à 49,1 Å et le puits à l'état haut de d = 59,0 Å à 74,1 Å. Le puits d'énergie beaucoup plus large dans l'état supérieur se traduit par une population d'équilibre dominante de 88 % sur la population de l'état inférieur de 12 %, malgré la faible différence d'énergie entre eux. La position du minimum d'énergie à l'état supérieur et de la barrière d'énergie se déplaçant vers l'état inférieur, passant de d = 70,6 Å à 67,6 Å et de d = 55,6 Å à 52,6 Å, respectivement. On note également que la hauteur de barrière énergétique entre les deux conformations stables est réduite à 5,1 ± 0,1 kcal/mol. En combinant les informations ci-dessus, nos résultats indiquent que l'élimination des glycanes non seulement renverse le rapport de population de l'état bas à l'état haut, mais a également un impact sur l'étendue de l'ouverture du RBD au minimum de l'état haut, les deux pouvant perturber la fonctionnalité de la protéine S. Des expériences ont également montré que l'élimination des glycanes autour du RBD (N234, N165 et N343)26,32 ou la diminution de la complexité des glycanes43 entraîne une diminution de la liaison à l'ACE2.

Pour quantifier la cinétique d'ouverture de la protéine S, nous avons calculé le temps moyen du premier passage (MFPT) le long du MEP en utilisant l'équation de diffusion de Smoluchowski pour le système glycosylé (voir la note complémentaire 1)44,45. L'équation de diffusion de Smoluchowski fournit une description simple d'une "particule" brownienne, reposant uniquement sur le coefficient de diffusion et l'énergie libre le long du MEP. Des simulations contraintes supplémentaires ont été exécutées pour déterminer le coefficient de diffusion le long du MEP en utilisant la fonction d'autocorrélation de vitesse (VACF)46,47. Le MFPT de l'état bas à l'état haut est de 1478,5 ms, tandis que l'inverse est de 0,9 ms. En comparant avec l'observation expérimentale par molécule unique FRET24, il apparaît que le MFPT descendant vers le haut est surestimé d'environ 5 × et celui pour la direction inverse est sous-estimé d'environ 100 ×, peut-être en raison du fait que nous n'avons pas pris en compte la longue échelle de temps pour que les glycanes s'équilibrent lors du calcul du coefficient de diffusion. Nous avons également approché le MFPT pour le système non glycosylé. La barrière de transition réduite dans le PMF (Fig. 2c) a entraîné une réduction concomitante du MFPT, qui est de 143 μs pour la transition de bas en haut et de 497 μs pour la transition de haut en bas.

Ensuite, nous avons considéré la dynamique chimique selon les réactions appariées suivantes :

dans laquelle D représente l'état bas de la protéine S, U l'état haut et U:ACE2 l'état lié (Fig. 3a). Les taux d'ouverture/fermeture (kopen/kclose) sont déterminés par les MFPT et les taux de liaison/déliaison (kon/koff) pour RBD seul à ACE2 sont tirés de Lan et al.22. Après avoir résolu l'équation principale de ces réactions ([ACE2]i = 15 nM ; voir la note complémentaire 1), nous constatons que pour la protéine S non glycosylée, les populations sont liées à 70 %, 23 % vers le haut mais non liées et seulement 7 % vers le bas (Fig. 3b). Un balayage mutationnel profond du RBD a révélé que toute mutation de N343, qui élimine le glycane lié à cette position, est préjudiciable à la liaison, avec un ΔΔG déduit de +0,35 à 2,03 kcal/mol48. En utilisant nos taux approximatifs d'ouverture/fermeture pour la protéine S non glycosylée mais en modifiant les taux de liaison/dissociation en fonction des données de mutation, nous constatons que la population à l'état lié diminue entre 8 % (ΔΔG = 2,03 kcal/mol ; Fig. 3d) et 57 % (ΔΔG = 0,35 kcal/mol ; Fig. 3c). Ainsi, même si l'élimination de tous les glycanes augmente la faveur de l'état positif, une réduction associée de l'affinité de liaison pourrait éliminer le gain autrement attendu dans la population liée à l'ACE2 (Fig. 3e).

a Les transitions entre les états RBD bas, haut et lié sont affichées avec leurs taux associés. b – d Fraction de protéines S dans chaque état (haut, bas et lié à ACE2) dans différentes conditions, à savoir b sans glycanes, c sans glycanes et une augmentation supposée de l'énergie libre de liaison de RBD à ACE2 de 0,35 kcal/mol, et d sans glycanes et une augmentation de l'énergie libre de liaison de 2,03 kcal/mol. e Fraction de l'état lié à l'équilibre pour les trois conditions en (b–d).

Pour mieux caractériser les effets des glycanes sur l'énergétique de l'ouverture des pointes, nous avons examiné comment le RBD interagit avec le reste de la protéine lorsque les glycanes sont présents ou absents dans les simulations REUS. Nous avons calculé le nombre de liaisons hydrogène entre le RBD-A d'ouverture et le reste de la protéine et l'avons tracé le long du paramètre de chemin (Figs. 4a, b, S2). Nous avons constaté que ce nombre diminue généralement à mesure que RBD-A s'ouvre, avec une nette augmentation des interactions après avoir traversé la barrière énergétique, davantage avec les glycanes que sans. Le nombre total de liaisons hydrogène formées avec RBD-A est plus élevé pour le système glycosylé, en particulier à l'état bas. Cependant, si nous ne tenons compte que des liaisons hydrogène protéine-protéine, le RBD-A non glycosylé a pu former davantage de connexions avec les autres domaines protéiques. La tendance générale à la baisse des interactions s'explique par le fait que RBD-A s'éloigne du reste de la protéine à mesure qu'elle s'ouvre et rompt par conséquent le contact avec le reste de la protéine trimérique S, y compris les RBD voisins et les domaines S2. Cependant, ce mouvement est insuffisant à lui seul pour expliquer l'augmentation des interactions après le franchissement de la barrière énergétique ainsi que les autres différences entre les simulations glycosylées et non glycosylées.

a, b Le long des MEP, comme indiqué par le paramètre de chemin λ (voir Fig. S2), le nombre de liaisons hydrogène formées entre l'ouverture RBD-A et le reste de la pointe est compté et classé par domaine pour les systèmes a glycosylé et b non glycosylé. Les emplacements des puits d'énergie à l'état bas et à l'état haut sont affichés sur fond blanc tandis que les autres régions sont ombrées en gris. c, d Le nombre moyen de contacts pour le système glycosylé formé entre les glycanes à c N122 et d N165 et le brin β voisin de NTD-B (165–172) et RBD-A (353–360), qui autrement formeraient des liaisons hydrogène entre eux s'ils n'étaient pas séparés par les glycanes. e Instantané de la simulation REUS montrant les glycanes à N165 et N122 perturbant la formation de liaisons hydrogène entre RBD-A et NTD-B, déstabilisant l'état positif par rapport au système non glycosylé.

En approfondissant les changements de composition des liaisons hydrogène le long du MEP, on en apprend davantage sur le rôle des glycanes dans la transition d'état de bas en haut. Alors que RBD-A forme la majorité de ses liaisons hydrogène avec les deux autres RBD et l'hélice HR1 / CH de l'unité S2 lorsqu'elle est à l'état bas, elle change radicalement pour interagir uniquement avec les NTD-B et RBD-C voisins à l'état haut (Figs. 4a, b, S3). Au cours de cette transition, il y a une pénurie de liaisons hydrogène stabilisatrices, contribuant à la barrière énergétique comme on le voit dans les PMF. Avec l'inclusion des glycanes, ils forment des interactions supplémentaires pour stabiliser la protéine, mais ils entrent également en concurrence avec les interactions protéine-protéine susmentionnées. Dans une structure compacte à l'état bas, les liaisons hydrogène protéine-protéine existantes sont protégées de l'exposition aux glycanes, laissant les glycanes former de nouvelles interactions à la surface de la protéine, ce qui entraîne une augmentation globale du nombre de liaisons hydrogène formées avec RBD-A par rapport au système non glycosylé. Cependant, une telle protection ne se produit pas à l'état haut. Avec RBD-A en place et exposé, ses interactions avec NTD-B sont limitées. Plus précisément, la plupart des liaisons hydrogène entre RBD-A et NTD-B sont déplacées par des interactions avec les glycanes à N165 et N122 une fois que RBD-A est soulevé suffisamment haut pour qu'ils s'intercalent entre les deux (Fig. 4c-e). En conséquence, les glycanes favorisent indirectement l'état bas, contribuant à l'énergie libre plus élevée de l'état haut pour le système glycosylé.

L'extension de notre analyse des liaisons hydrogène au-delà du MEP et à l'ensemble de l'espace variable collectif 2D nous permet de mieux comprendre les différences entre les paysages d'énergie libre des simulations REUS avec et sans glycanes. Nous avons tracé le nombre moyen de liaisons hydrogène entre l'ouverture RBD-A et son voisin NTD-B en fonction des deux variables collectives, d et ϕ, montrant que l'augmentation des interactions entre RBD-A et NTD-B n'est pas limitée aux états le long du MEP mais comprend également une grande région du côté + d de la barrière d'énergie (Fig. S4a). Fait intéressant, le nombre de liaisons hydrogène entre RBD-A et NTD-B culmine à ϕ = 40∘ et diminue lentement à mesure que ϕ augmente, faisant écho au résultat précédent selon lequel lorsque RBD-A s'éloigne du NTD-B, les glycanes interviennent et bloquent les interactions entre les deux domaines. Du côté − d de la barrière d'énergie, l'inverse se produit pour les liaisons hydrogène entre RBD-A et RBD-C, où RBD-A et RBD-C sont les plus proches l'un de l'autre lorsque ϕ est grand et a donc le plus grand nombre de liaisons hydrogène (Fig. S4b). Cette observation explique le pli du MEP lors du franchissement de la barrière énergétique pour le système glycosylé. Afin de maximiser le nombre de liaisons hydrogène stabilisant RBD-A, la pointe quitte le puits d'énergie à l'état bas avec un grand ϕ pour maintenir un contact maximal entre RBD-A et RBD-C, avant de passer brusquement à un plus petit ϕ lors de l'entrée dans le puits d'énergie à l'état haut pour maximiser le contact avec NTD-B.

Afin d'évaluer la dynamique à long terme des glycanes, nous avons effectué deux simulations d'équilibre de 2 μs des systèmes glycosylés et non glycosylés. Lorsqu'ils sont projetés sur les deux variables collectives utilisées dans REUS, les trois protomères à l'état bas pour les deux répliques sont restés dans la conformation bas, avec et sans glycanes (Fig. S5). Bien qu'aucune transition entre les états haut et bas ne se soit produite pendant les simulations d'équilibre, les états hauts présentent une flexibilité beaucoup plus élevée que les états bas pour les systèmes glycosylés et non glycosylés, reflétant la différence de taille entre les deux puits d'énergie trouvés à partir des simulations REUS. Fait intéressant, alors que le RBD-A non glycosylé échantillonne autour du minimum d'énergie à l'état supérieur sans biais directionnel évident, le RBD-A glycosylé montre une tendance à se déplacer vers la direction - d à partir du minimum à l'état supérieur le long du MEP. Ce résultat, encore une fois, s'aligne sur les simulations REUS montrant que le puits d'énergie à l'état supérieur pour le système glycosylé a un gradient plus petit vers la barrière d'énergie que loin de celle-ci, alors que celui du système non glycosylé est plus symétrique (Fig. 2c).

Nous avons également analysé les interactions des glycanes autour de RBD-A, à savoir ceux à N165, N234 et N343 de la chaîne voisine B, en utilisant les simulations d'équilibre ainsi que les trajectoires REUS le long du MEP. Récemment, Amaro et ses collègues ont mené des simulations MD sur tous les atomes et des expériences de mutation pour étudier les rôles individuels des glycanes ci-dessus lors de l'ouverture des pointes26,32. Conformément à leurs résultats, nous avons observé le basculement du glycane à N234 de l'extérieur vers l'intérieur lors de l'ouverture du pic ainsi que l'effet de déclenchement du glycane par le glycane à N343 (film supplémentaire 2).

Nos simulations révèlent également les rôles des glycanes à N165 et N343 dans la stabilisation des états haut et bas. Plus précisément, lorsque RBD-A est à l'état bas, les glycanes de N165 et N343 s'enroulent autour du RBM (Fig. 5a), le maintenant à l'état bas. Une interaction similaire a été observée dans une autre étude lorsqu'un glycane à N370 a été introduit artificiellement ; il s'est enroulé autour du RBD de l'état bas comme un "lacet"21. Remarquablement, le glycane à N165 stabilise également le RBD à l'état supérieur en soutenant une partie du RBM exposé (Fig. 5b). Le contact inter-glycane entre les glycanes à N343 et N165 est significativement plus élevé à l'état haut par rapport à l'état bas (Fig. S6), ce qui suggère que le glycane à N343 stabilise indirectement l'état haut en interagissant avec le glycane à N165 (Fig. 5b). Les deux glycanes empêchent également le RBM flexible de se fixer au RBD à l'état bas voisin et de devenir inaccessible à l'ACE2, comme observé dans l'une de nos simulations d'équilibre du système non glycosylé (Fig. S7).

Emplacements représentatifs des glycanes de la protéine S à N165, N234 et N343 dans les états bas et b de la protéine S extraits des trajectoires REUS. c Représentation de surface des résidus RBD dans les états (au-dessus) vers le bas et (en dessous) vers le haut qui entrent en contact avec les glycanes à N165 (vert) et N343 (orange). Le motif hachuré indique les contacts avec les deux glycanes. Les états haut et bas de la protéine S ont été sélectionnés à partir du MEP.

Les observations ci-dessus sont confirmées par l'analyse des contacts sur les trajectoires REUS le long du MEP. Les glycanes à N165 et N343 interagissent tous les deux avec le RBM à l'état bas, comme illustré par les valeurs de contact moyennes entre RBD-A et les glycanes à N165 et N343 (Figs. S8, S9). Lorsque le pic s'ouvre, le glycane de N165 passe pour interagir avec les résidus RBD-A sous le RBM, tandis que le glycane de N343 entre à peine en contact avec RBD-A après que le système a franchi la barrière d'activation de l'ouverture (Fig. 5c). L'analyse de contact pour l'état bas capture également les résidus RBM (F456, R457, Y489 et F490) impliqués dans la synchronisation des glycanes, comme indiqué précédemment par Sztain et al.32.

Les structures cryo-EM de la protéine S incluent souvent une double mutation de la proline, K986P/V987P, située dans le virage entre HR1 et le CH. Des études antérieures sur le SRAS-CoV et le MERS-CoV, ainsi que sur d'autres protéines de fusion de classe I, ont établi que la présence de cette paire de prolines dans le virage HR1-CH stabilise la structure du pic de pré-fusion et augmente l'expression des protéines, deux aspects importants de la conception du vaccin49. La structure de la protéine S de Cai et al.12 conserve la séquence WT K986/V987, plutôt que les doubles mutations de proline couramment effectuées dans la production de protéines de pointe de pré-fusion stabilisées ; ils signalent un déplacement vers l'intérieur (et donc un tassement plus serré) des sous-unités S1 par rapport aux structures d'ectodomaine solubilisées antérieures12. En fait, la perte d'un pont salin putatif entre K986 et un acide aspartique (D427/D428) sur un protomère adjacent a été impliquée dans la production des structures les moins compactes observées dans les constructions mutantes solubilisées12. Gobeil et al.11 rapportent que pour la construction de la protéine S D614 avec le site furine retiré, la présence des prolines produit des structures, la liaison ACE2, la stabilité thermique et la liaison des anticorps qui sont remarquablement similaires à la paire WT K986/V987. Dans nos simulations d'équilibre, ce pont de sel a une occupation d'environ 30 %, en moyenne sur les trois protomères dans les deux trajectoires indépendantes. La réduction de l'occupation susmentionnée du pont salin provient de la concurrence avec les ponts salins intra-protomères entre K986 et les résidus acides voisins E748, E990 et D985, présents dans la plage d'environ 15 à 25 %, suggérant une interaction transitoire entre K986 et les acides aspartiques RBD (D427/D428). Ces interactions concurrentes sont illustrées à la Fig. S10.

Nous avons répété la simulation REUS avec la mutation diproline pour le système non glycosylé. Le PMF résultant affiche une différence d'énergie modeste entre les états RBD bas et haut favorisant l'état haut (Fig. S11), similaire à celle observée dans le WT PMF (Fig. 2b) pour ces constructions D614 ancestrales. La similitude entre les puits d'énergie à l'état bas et à l'état haut par rapport à ceux de WT (Fig. 2b) suggère que la mutation diproline ne produit qu'une perturbation modeste de leurs populations relatives dans ces systèmes non glycosylés. Contrairement aux minima, la barrière chez le mutant diproline semble augmenter, suggérant une modulation de la cinétique d'ouverture. Compte tenu de la nature transitoire des ponts salins K986 et des énergies relatives similaires des états RBD bas/haut, un impact supplémentaire des mutations de la proline est susceptible d'être leur tendance à rompre et à déformer les hélices α. La région de virage HR1-CH subit un grand changement conformationnel lors de la transition des états pré- à post-fusion, formant une hélice α étendue12. La présence des prolines, résidus connus pour casser/entortiller les hélices α, inhibe la formation de la longue hélice α caractéristique de la conformation post-fusion49. Il convient de noter que des simulations récentes de Wang et al.50 explorant la transition des états pré- à post-fusion ont montré que si la séquence WT à 986/987 a tendance à devenir hélicoïdale, le remplacement par des prolines perturbe la formation de cette structure secondaire.

Actuellement, près de dix mille anticorps neutralisants ciblant la protéine S du SRAS-CoV-2 ont été découverts. La cible la plus importante est la protéine S RBD51,52, bien que certains ciblent le NTD et d'autres épitopes non-RBD53. Selon la base de données CoV-AbDab continuellement mise à jour54, un total de 9906 (et en augmentation) anticorps neutralisants ciblent la protéine S, tandis que seulement 3955 ciblent des épitopes non-RBD. L'un des avantages du ciblage d'épitopes non RBD sur la protéine S est qu'ils peuvent être reconnus même lorsque le RBD est dans une conformation vers le bas20,55. En revanche, le RBD ne peut être identifié que dans la conformation vers le haut en raison de la forte couverture en glycanes du RBD dans la conformation vers le bas26.

Pour comprendre l'effet de la dynamique d'ouverture des pointes sur l'exposition aux épitopes, nous avons calculé la surface accessible d'un certain nombre d'épitopes le long du MEP identifié à partir de REUS. Nous avons sélectionné sept anticorps différents16,17,56,57,58,59,60 avec des épitopes couvrant plusieurs régions sur RBD-A (y compris des épitopes cryptiques) et le NTD-B de la protéine S. Les détails de ces anticorps sont fournis dans le tableau S3. Nous avons effectué des calculs distincts de surface accessible aux anticorps (AbASA), incluant et excluant les glycanes en utilisant la même approche d'échantillonnage avec une sonde de 7 Å. Une taille de sonde similaire20 ainsi qu'une sonde plus petite33 ont été utilisées dans des études antérieures. Bien que cette taille de sonde modérée (7-Å) puisse faire apparaître certaines crevasses légèrement exposées20, elle est optimale pour les épitopes cryptiques33.

En général, l'AbASA reste le même ou augmente considérablement lorsque RBD-A passe à l'état haut. L'épitope de l'anticorps STE90-C1159 présente un saut en AbASA lors de la transition de bas en haut. L'anticorps CR3022 se lie à un épitope cryptique57, qui est complètement recouvert à l'état bas et n'est que légèrement exposé à l'état haut. Les résidus protéiques recouvrent cet épitope de la même manière tout au long de la voie d'ouverture des pointes pour les MEP avec et sans glycanes (Fig. S12). Remarquablement, l'AbASA de l'anticorps 2-4 ne change pas pendant la transition de bas en haut du RBD, bien que l'épitope soit situé dans le RBM (Fig. 6a). Par conséquent, nous concluons que l'ensemble du RBM n'est pas exposé même à l'état haut. L'AbASA pour l'épitope de l'anticorps 4A8 ne change pas de manière significative lors de l'ouverture du pic puisque son épitope est situé dans l'extrémité N-terminale17, qui n'a pas subi de changements conformationnels. L'épitope AbASA de S2M11 ne change pas le long du chemin d'ouverture du pic. De plus, une partie de l'épitope du S2M11 se trouve sur le RBD du protomère adjacent, qui ne s'ouvre pas dans nos simulations. L'épitope de l'anticorps S2M1160 chevauche légèrement le RBD d'un protomère (résidus 440, 441 et 444), tandis que la majorité coïncide avec le site de liaison du glycane ACE2 à N322 sur le RBD (résidus 369, 371 à 374 et 440)61. Étonnamment, l'épitope de l'anticorps S30958 devient moins exposé à l'état haut sans augmentation de la couverture par les glycanes (Fig. 6b), indiquant qu'une partie du RBD (Tableau S3) devient également moins exposée à l'état haut par rapport à l'état bas.

a Zone exposée sur des épitopes d'anticorps (AbASA) en présence de protéines et de glycanes. b Surface d'épitopes recouverte de glycanes le long du MEP quantifiée en soustrayant les deux valeurs d'AbASA calculées avec et sans glycanes. Tous les calculs de surface accessible ont été effectués à l'aide d'une sonde de 7 Å.

Il convient de noter que les épitopes d'anticorps choisis ici se trouvent dans le NTD et le RBD de la pointe, les régions primaires des mutations variantes avec une évasion de neutralisation efficace5,62,63. Les anticorps impactés comprennent STE90-C11, 4-8, S2M11, BD-368-2 par Omicron BA.162,64,65 et une évasion accrue de S309 par Omicron BA.2, BA.4/BA.563. Dans ce dernier cas, la perte de neutralisation implique une région proximale au glycane N343, soulignant le rôle important des glycanes dans la réponse immunitaire.

L'infection par le SRAS-CoV-2 est initiée lorsqu'un récepteur ACE2 se lie à la protéine S, qui s'interconvertit entre les états haut et bas, seul l'état haut permettant la liaison à l'ACE2. Par conséquent, l'énergétique de l'interconversion contrôle l'initiation de l'infection. À cette fin, nous avons calculé un paysage énergétique bidimensionnel de l'interconversion up-down de la protéine SARS-CoV-2 S. En utilisant un total agrégé de 160 μs de calculs REUS, nous élucidons les rôles collectifs des glycanes de la protéine S dans sa dynamique d'ouverture. Nos résultats indiquent que la barrière d'énergie libre de l'ouverture des pointes est supérieure d'environ 7 kcal/mol en présence de glycanes par rapport à la pointe entièrement non glycosylée. Alors que l'énergie libre favorise grandement l'état bas en présence des glycanes, la différence d'énergie entre les deux états de la protéine S diminue en dessous de l'erreur statistique sans glycanes. On peut supposer que davantage de protéines S à l'état supérieur présenteraient une plus grande chance de se lier aux récepteurs ACE2 et donc d'augmenter leur aptitude virale. Cependant, il y a quelques effets opposés à avoir plus de protéines S à l'état supérieur, comme indiqué par des études antérieures26,66 et réaffirmé par notre analyse. Le RBD à l'état bas est fortement protégé par les glycanes20,26, tandis qu'à l'état haut, il est plus exposé aux anticorps neutralisants (Fig. 6a). De plus, la liaison de l'ACE2 dépend fortement de l'affinité de liaison entre l'ACE2 et la protéine S, qui peut impliquer des interactions avec les glycanes ainsi qu'avec les protéines. Par conséquent, une population élevée dans l'état supérieur ne reflète pas nécessairement une population élevée dans l'état lié à l'ACE2.

La description au niveau atomique décrite ici, et ailleurs26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36, devient particulièrement pertinente à la lumière du rôle central que joue la dynamique dans le fonctionnement de la protéine de pointe. Bien que les structures cryo-EM aient été une pièce maîtresse dans la délimitation de ces états, les transitions entre eux ainsi que les états intermédiaires ne sont pas disponibles. MD fournit un outil complémentaire à ces études expérimentales pour obtenir une image plus complète du fonctionnement de ces protéines, y compris les effets cinétiques des glycanes altérés. De plus, même les populations relatives des états bas et hauts ne sont pas sans incertitude. Par exemple, bien que la structure cryo-EM récente de la variante d'ectodomaine d'Omicron ait principalement un RBD67 1-up, des populations alternatives sont signalées68 et la pointe pleine longueur semble prendre en charge un ensemble de RBD 2-up/1-down69. Une telle diversité de conformations est probablement le résultat de constructions alternatives et/ou de conditions expérimentales68.

Les épitopes des anticorps sur la pointe peuvent être protégés soit par des résidus protéiques, soit par des glycanes, et la couverture fournie par chacun change d'une manière dépendante de l'épitope le long du chemin d'ouverture de la pointe. L'anticorps STE90-C11 présente la plus grande exposition à l'épitope lorsque le RBD est en hausse, tandis que l'anticorps BD-368-2 a un épitope qui est toujours exposé de manière significative, quelle que soit la position du RBD. De plus, l'exposition de l'épitope BD-368-2 est très similaire à l'épitope de STE90-C11 à l'état haut. Par conséquent, ces deux anticorps présentent une efficacité très élevée pour neutraliser la protéine S du SRAS-CoV-2, tous deux avec des valeurs IC50 sous-nanomolaires56,59. L'anticorps CR3022 se lie à un épitope cryptique ; par conséquent, son AbASA est plus petit par rapport aux autres épitopes. Cependant, le manque de surface exposée, même à l'état haut, est compensé par de fortes interactions électrostatiques à l'interface épitope-CR302270. Notez que le S309 Fab se lie à un épitope de protéoglycane, qui comprend le glycane à N343. Cependant, comme la plupart de l'épitope S309 ne fait pas partie du RBM, il peut se fixer à la protéine de pointe dans les états bas et haut58. L'effet peut être annulé par des mutations proches du N343, comme observé pour la variante Omicron63.

Nous avons analysé les interactions des glycanes individuels avec différents domaines de la protéine S en utilisant les deux MEP obtenus, un avec et un sans glycanes. Les glycanes à N122 et N165 perturbent les liaisons hydrogène entre le RBD-A d'ouverture et le NTD-B voisin, déstabilisant l'état positif et poussant ainsi la population d'équilibre vers l'état négatif par rapport au système non glycosylé. Les glycanes à N165 et N343 stabilisent également l'état bas de RBD-A en s'enroulant autour du RBM. Inversement, le glycane à N343 sert de soi-disant "porte glycane" soutenant le RBM32, tandis que le glycane à N165 aide en soutenant le RBD-A à l'état supérieur à l'aide du glycane à N343. Par conséquent, ces deux glycanes stabilisent les états bas et haut, contribuant à un minimum d'énergie local pour chacun. Le rôle compliqué du glycane à N165 peut expliquer des résultats expérimentaux contradictoires quant à savoir si la mutation N165A augmente ou diminue la liaison des pointes26,71.

La protéine de pointe est la cible principale des anticorps neutralisants, présentant un assortiment d'épitopes dans les états bas et haut, et constitue la base des vaccins et rappels actuels5,15,16,17. Sous la pression évolutive, le pic subit une mutation rapide, avec l'émergence de variantes plus transmissibles avec une fuite d'anticorps accrue5. Bien que le virus continue de muter, à ce jour, les vaccins et les rappels semblent offrir une protection adéquate. Une approche efficace pour traiter la pandémie prolongée continue d'être l'identification et l'évaluation des régions immunologiques importantes sur le pic, à la fois dans les états bas et haut ainsi que les transitions entre elles, d'autant plus qu'il semble que le pic continuera à muter et potentiellement compromettre les vaccins/boosters actuels. Compte tenu de la structure et de la dynamique modifiées signalées pour les variants de pointe du SRAS-CoV-211,25,67,68, une description détaillée de l'énergétique et de la cinétique pour l'ouverture de la protéine de pointe est nécessaire, et les approches informatiques décrites ici fournissent un outil complémentaire précieux dans le développement de traitements efficaces.

En conclusion, nous avons calculé l'énergétique le long du chemin d'ouverture des pointes pour la protéine S du SRAS-CoV-2 avec un aperçu au niveau atomique des rôles des glycanes dans le processus d'ouverture. De plus, nous avons mis en évidence l'impact de l'énergétique d'ouverture des pointes sur la cinétique de la liaison à l'ACE2 et de l'exposition aux épitopes. Ces découvertes, en particulier les conformations le long de la voie d'ouverture des pointes, faciliteront la conception de nanocorps et d'anticorps efficaces pour lutter contre la crise actuelle du COVID-19.

Nous avons modélisé les états haut et bas sur la base des structures de cryo-microscopie électronique (cryo-EM) de Walls et al.10 (PDB : 6VYB) et de Cai et al.12 (PDB : 6XR8) à l'aide de VMD72. La structure à l'état bas rapportée par Cai et al. est une construction de protéine S WT pleine longueur purifiée par un détergent à une résolution de 2,9 Å12. Il présente plusieurs différences critiques avec les structures rapportées antérieurement : (i) une NTD plus résolue avec un site de glycosylation supplémentaire à N17, (ii) la séquence WT dans la région centrale de l'hélice/boucle, plutôt que la mutation 2PP stabilisant la pré-fusion, et (iii) un segment d'environ 25 résidus, les résidus 828-853, qui n'étaient pas résolus auparavant. Cette dernière région est adjacente à une lysine critique (K854) qui fournit un partenaire de pont salin pour D614. La perte de ce pont salin a été impliquée dans l'infectiosité accrue des souches D614G SARS-CoV-2. En outre, Cai et al.12 ont également résolu deux liaisons disulfure qui manquaient auparavant, une dans le N-terminal (C15-C136) et une autre dans la région centrale de l'hélice/boucle (C840-C851). Dans notre modèle, les résidus manquants dans les structures à l'état bas ont été ajoutés avec le modèle SWISS73 en utilisant la structure 6XR8 comme modèle. Le modèle a été clivé au site de clivage de la furine entre les résidus R685 et S686. La partie S1, qui contient le RBD et le NTD, est plus étroitement emballée dans la structure 6XR8 par rapport au 6VXX, et la partie S2, qui contient le HR1 et le CH, est alignée entre eux12. Les parties S1 et S2 de notre modèle incluent respectivement les résidus N14-R685 et S686-S1147. Dix liaisons disulfure sont ajoutées dans la partie S1 entre les résidus C15-C136, C131-C166, C291-C301, C336-C361, C379-C432, C391-C525, C480-C488, C538-C590, C617-C649 et C662-C671 et cinq sont ajoutées au S 2 pièces C738-C760, C743-C749, C840-C851, C1032-C1043 et C1082-C1126. Les parties manquantes à l'état haut ont été modélisées à l'aide du modèle d'état bas minimisé. Les sites de glycosylation sont situés sur N17, N61, N74, N122, N149, N165, N234, N282, T323, N331, N343, N603, N616, N657, N709, N717, N801, N1074, N1098 et N1134. Dans l'ensemble, il y a 19 glycanes liés à N et 1 glycanes liés à O présents dans chaque protomère, ce qui donne un total de 60 glycanes pour un modèle de trimère de protéine S. Le glycane de chaque site avec la population la plus élevée dans les données de spectroscopie de masse de Crispin et ses collaborateurs19 a été ajouté au site à l'aide du serveur Web GLYCAM développé par le groupe Woods (http://glycam.org)37,38. Les compositions de glycanes sont illustrées à la Fig. S13. Les atomes d'hydrogène manquants ont été ajoutés à tous les systèmes, après quoi ils ont été solvatés dans une boîte à eau de 195 × 193 × 212 Å3. Nous avons ajouté des ions Na+ et Cl− pour obtenir une concentration en sel d'environ 0,150 M. Le nombre d'atomes dans les protéines, l'eau, le glycane et les ions est resté le même pour les calculs REUS. Les systèmes (états haut ou bas) contiennent un total de 758 531 atomes (63 312 atomes de protéines et de glycanes, 661 Na+, 652 Cl−) et 633 864 atomes (52 476 atomes de protéines, 549 Na+, 546 Cl−) avec et sans glycanes, respectivement. La différence dans le nombre d'ions provient (1) de la plus grande boîte à eau nécessaire pour accueillir les glycanes et (2) de la charge négative de l'acide sialique (marqué Neu5Ac sur la Fig. S13) présent dans les glycanes O-liés.

Toutes les simulations ont été effectuées à l'aide de NAMD 2.1474,75 avec le champ de force protéique CHARMM36m76, le champ de force glycane CHARMM3677 et l'eau TIP3P78. Chaque système a été équilibré pendant 5 ns avec la température et la pression fixées à 310 K et 1 atm, respectivement, en utilisant la dynamique de Langevin et piston79, respectivement. Un pas de temps uniforme de 4 fs a été employé grâce à l'utilisation de la répartition de la masse d'hydrogène (HMR)80,81. L'électrostatique à longue portée a été calculée à chaque pas de temps en utilisant la méthode d'Ewald à mailles de particules82. Une coupure à courte portée pour les interactions de Lennard-Jones a été fixée à 12 Å, avec une fonction de commutation commençant à 10 Å. Les liaisons impliquant des atomes d'hydrogène ont été contraintes à leur longueur d'équilibre, en utilisant l'algorithme SETTLE pour les molécules d'eau et l'algorithme SHAKE pour toutes les autres.

Après équilibrage, nous avons exécuté deux simulations métadynamiques indépendantes le long des deux variables collectives d et ϕ (définies à la Fig. 1) pour chaque système (WT glycosylé, WT non glycosylé et non glycosylé avec mutation diproline), l'une à partir de l'état bas et l'autre à partir de l'état haut. Le module colvars de NAMD a été utilisé pour construire toutes les variables collectives83. Les biais ont été déposés avec une hauteur de colline de 0,2 kcal/mol, une largeur de 1,0 Å et 1,0∘ pour d et ϕ, respectivement, et un taux de 1 ps−1. Les systèmes étaient confinés aux d et ϕ dans la gamme des structures cryo-EM des états bas (PDB : 6XR8) et haut (PDB : 6VYB). La température a été maintenue à 310 K en utilisant la dynamique de Langevin et le volume a été maintenu constant.

Nous avons ensuite utilisé les trajectoires métadynamiques pour ensemencer les exécutions REUS selon la procédure suivante. Pour chaque système, deux PMF préliminaires ont été générés, un à partir de la métadynamique de l'état bas et un autre à partir de celle de l'état haut. L'espace conformationnel a été divisé en petites grilles et chaque grille est devenue une seule fenêtre REUS à l'étape suivante. Les fenêtres dont les PMF des métadynamiques à l'état bas et à l'état haut sont inférieures à un certain seuil (tableau S2) ont été abandonnées et ne seraient pas utilisées dans la simulation REUS. Pour les grilles restantes, nous avons choisi un instantané de la trajectoire métadynamique descendante (Fdown) ou ascendante (Fup) en fonction du poids de Boltzmann de leur PMF respectif.

Si Pdown > Pup, un instantané de la trajectoire métadynamique à l'état bas a été sélectionné pour cette grille et vice versa. Avec cela, 387 fenêtres (181 à partir du bas, 206 à partir du haut) ont été sélectionnées pour le système glycosylé WT ; 392 fenêtres (79 à partir du bas, 313 à partir du haut) pour le système non glycosylé WT ; et 353 fenêtres (119 à partir du bas, 234 à partir du haut) pour le système non glycosylé avec mutation diproline.

Pour le système glycosylé, nous avons en outre effectué un recuit simulé sur les glycanes pour tous les instantanés extraits des simulations métadynamiques. À partir de 1 000 K, les systèmes ont été lentement refroidis jusqu'à la température physiologique par paliers de 823 K, 677 K, 557 K, 458 K, 377 K et 310 K. Chaque température a été exécutée pendant 2 ns. Au cours de la simulation, tous les atomes de protéines ont été fixés et les glycanes, les molécules d'eau et les ions ont pu se déplacer librement. En raison des vitesses élevées des atomes à 1000 K et 823 K, un pas de temps de 2 fs a été utilisé avec HMR. Pour des températures inférieures ou égales à 677 K, un pas de temps de 4 fs a été utilisé avec HMR. Les autres paramètres de simulation étaient identiques à ceux utilisés précédemment. Les conformations finales des anneaux des glycanes ont été confirmées comme étant conformes aux valeurs attendues (Fig. S14).

Avec les configurations initiales préparées, nous avons exécuté des simulations REUS pour chaque système le long de d et ϕ dans les régions sélectionnées selon la simulation métadynamique PMF. Les plages de d et ϕ vont de 44,0 Å à 72,5 Å et de –56,0∘ à 1,0∘, respectivement. Les constantes de force de retenue le long de d et les centres des fenêtres ont été ajustées pour assurer un chevauchement et un échange suffisants entre les fenêtres voisines. Les constantes de force le long de ϕ ont été maintenues constantes à 1,0 kcal mol−1deg−2. Les simulations REUS du système glycosylé WT, du système non glycosylé WT et du système non glycosylé avec mutation diproline ont été exécutées pendant 32 ns, 36 ns et 29 ns, respectivement. Les paramètres de simulation étaient identiques à ceux utilisés dans les simulations métadynamiques. Les données d'échantillonnage de REUS ont été utilisées pour calculer le PMF pour chaque système à l'aide du Multistate Bennett Acceptance Ratio (MBAR), implémenté dans le module Python pymbar84. Pour les systèmes WT glycosylés et non glycosylés, nous avons exécuté trois autres cycles de simulations REUS en utilisant des instantanés extraits des cycles précédents de la même manière que pour les simulations métadynamiques. Pour le deuxième tour, les régions de simulation ont été resélectionnées à l'aide d'un nouveau seuil d'énergie basé sur les PMF calculés à partir du premier tour de REUS (tableau S2). Les constantes de force de retenue et les centres des fenêtres ont également été recalibrés. Le deuxième cycle de REUS pour les systèmes WT glycosylés et non glycosylés a été exécuté pendant 37 ns et 56 ns, respectivement. À la lumière du résultat du deuxième tour de REUS, nous avons lancé un troisième tour de REUS, élargissant la région PMF pour couvrir entièrement les deux puits d'énergie. Deux simulations REUS indépendantes ont été exécutées au cours du troisième tour pour chacun des puits d'énergie. Les plages de d et ϕ étaient de 40,5 Å à 51,0 Å et de –66,5∘ à –21,5∘, respectivement, pour le REUS à l'état bas. Les plages de d et ϕ étaient de 57,5 ​​Å à 99,5 Å et de –35,5∘ à 45,5∘, respectivement, pour le REUS à l'état supérieur. De nouvelles simulations métadynamiques ont été exécutées pour amorcer des régions jamais échantillonnées par les simulations REUS précédentes. Encore une fois, les fenêtres ont été sélectionnées en fonction d'une nouvelle coupure d'énergie (tableau S2), et les constantes de force de retenue et les centres des fenêtres ont été calibrés pour maximiser le chevauchement et les échanges entre les fenêtres voisines. Les troisièmes cycles de REUS pour les systèmes à l'état bas et à l'état haut glycosylés WT ont été exécutés pendant 16 ns et 12 ns, respectivement, et ceux pour le système non glycosylé étaient de 33 ns et 28 ns, respectivement. Enfin, un dernier cycle de REUS a été organisé pour couvrir toute la gamme, de l'état bas à l'état haut. Toutes les fenêtres des tours 2 et 3 ont été adoptées, avec quelques-unes ajoutées sur les bords pour s'assurer que toutes les régions à faible énergie étaient couvertes (tableau S2). Le REUS pour le système non glycosylé WT a été exécuté pendant 36 ns directement en utilisant les dernières images des cycles précédents de REUS. Pour le système glycosylé, nous avons généré de nouvelles structures d'ensemencement à partir du REUS non glycosylé pour les fenêtres autour de la barrière d'énergie afin d'aider à combler l'écart entre les structures à l'état bas et à l'état haut dans la simulation du REUS glycosylé. En utilisant les structures des cycles précédents de REUS et les structures nouvellement générées à partir de la simulation REUS non glycosylée terminée, le REUS glycosylé a été exécuté pendant 36 ns. Les données présentées pour les systèmes WT sont basées sur la combinaison des données du deuxième au dernier cycle de REUS. Le temps total d'agrégation des données de simulation utilisées pour le système glycosylé WT, le système non glycosylé WT et le système non glycosylé avec mutation diproline REUS était de 65 μs, 91 μs et 12 μs, respectivement.

Pour les simulations d'équilibre, deux répliques initialisées avec des graines aléatoires différentes ont été exécutées. De plus, nous avons évalué la convergence de nos PMF en utilisant les incertitudes fournies par MBAR, et elles sont toutes inférieures à 0,2 kcal/mol sauf sur les bords des PMF.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données sources pour les PMF de la Fig. 2 sont fournies en tant que données supplémentaires 1. Les conformations de la protéine S, le MEP pour chacun des trois PMF et les fichiers de configuration NAMD sont disponibles au NSF MolSSI COVID-19 Molecular Structure and Therapeutics Hub à https://covid.molssi.org/simulations/#pmf-calculations-of-sars-cov-2-spike-opening.

VMD et NAMD sont disponibles sur https://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/et https://www.ks.uiuc.edu/Research/namd/, respectivement. L'implémentation MBAR utilisée est disponible sur https://github.com/choderalab/pymbar.

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Une récompense de temps d'ordinateur sur le supercalculateur Summit du laboratoire national d'Oak Ridge a été attribuée par le biais du Consortium de calcul haute performance COVID-19. Des ressources de calcul supplémentaires ont été fournies par le biais de l'Extreme Science and Engineering Discovery Environment (XSEDE ; TG-MCB130173), qui est soutenu par la National Science Foundation (NSF ; ACI-1548562). Ce travail a également utilisé le cluster Hive, qui est soutenu par la NSF sous le numéro de subvention 1828187 et est géré par le Partnership for an Advanced Computing Environment (PACE) du Georgia Institute of Technology. Les auteurs remercient Mahmoud Moradi pour ses conseils dans le calcul du temps moyen de premier passage. YTP est soutenu par une bourse Frontera du Texas Advanced Computing Center (TACC). Frontera est soutenu par la subvention NSF n° OAC-1818253.

Atanu Acharya

Adresse actuelle : BioInspired Syracuse and Department of Chemistry, Syracuse University, Syracuse, NY, 13244, USA

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Yui Tik Pang, Atanu Acharya.

École de physique, Georgia Institute of Technology, Atlanta, GA, 30332, États-Unis

Yui Tik Pang, Atanu Acharya, Diane L. Lynch, Anna Pavlova et James C. Gumbart

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Recherche conçue par YTP, AA, DLL et JCG ; YTP, AA, DLL et AP ont effectué des recherches et analysé des données ; et tous les auteurs ont écrit le manuscrit.

Correspondance à James C. Gumbart.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Elisa Fadda, Peter Coveney et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteur en chef de la gestion principale : Gene Chong.

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Réimpressions et autorisations

Pang, YT, Acharya, A., Lynch, DL et al. La dynamique et l'énergétique d'ouverture du pic SARS-CoV-2 révèlent les rôles individuels des glycanes et leur impact collectif. Commun Biol 5, 1170 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04138-6

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Reçu : 01 septembre 2021

Accepté : 20 octobre 2022

Publié: 03 novembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-022-04138-6

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