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Aug 04, 2023

Concevoir des agonistes des récepteurs avec une pharmacocinétique améliorée en greffant des peptides macrocycliques dans des régions cristallisables de fragments

Nature Génie biomédical

Nature Biomedical Engineering volume 7, pages 164–176 (2023)Citer cet article

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De courtes demi-vies dans la circulation et un mauvais transport à travers la barrière hémato-encéphalique limitent l'utilité des cytokines et des facteurs de croissance agissant comme agonistes des récepteurs. Ici, nous montrons que des agonistes de récepteurs de substitution avec des demi-vies plus longues en circulation et des taux de transport améliorés à travers la barrière hémato-encéphalique peuvent être générés en insérant génétiquement des pharmacophores peptidiques macrocycliques dans les boucles structurelles de la région fragment cristallisable (Fc) d'une immunoglobuline humaine. Nous avons utilisé une telle approche de « greffage au lasso », qui préserve les niveaux d'expression de la région Fc et son affinité pour le récepteur Fc néonatal, pour générer des échafaudages protéiques à base de Fc avec des peptides macrocycliques se liant au récepteur tyrosine protéine kinase Met. Les agonistes Met ont dimérisé Met, induisant des réponses biologiques similaires à celles induites par son ligand naturel. De plus, la greffe au lasso de la région Fc de l'anticorps anti-récepteur de la transferrine de souris avec des peptides macrocycliques liant Met a amélioré l'accumulation des agonistes Met résultants dans le parenchyme cérébral chez la souris. La greffe de lasso peut permettre des thérapies protéiques de concepteur avec une stabilité et une pharmacocinétique améliorées.

L'utilisation clinique des cytokines et des facteurs de croissance en tant que thérapeutique a été approuvée par la Food and Drug Administration des États-Unis1,2, et leur application potentielle dans des domaines émergents, tels que la neurogenèse et la réparation du cerveau3,4, est un sujet de recherche intense. Cependant, leurs propriétés structurelles inhérentes les rendent difficiles à concevoir pour améliorer la stabilité physicochimique et la pharmacocinétique, en particulier, pour une meilleure demi-vie ou pénétrance de la barrière hémato-encéphalique (BBB). Les méthodes existantes qui contrôlent la pharmacocinétique des protéines thérapeutiques comprennent la conjugaison et la fusion du poly(éthylène glycol) avec la région fragment cristallisable (Fc) de l'immunoglobuline5,6,7 pour prolonger leur demi-vie ; et fusion avec le Fab de l'anticorps anti-récepteur de la transferrine (TfR) pour améliorer leur pénétration à travers la BBB8,9,10. Cependant, la mesure dans laquelle ces méthodes peuvent améliorer la pharmacocinétique des protéines sans nuire à leurs bioactivités dépend des propriétés de chaque protéine5,6,7,8. Pour surmonter les limitations structurelles inhérentes aux cytokines et aux facteurs de croissance, des progrès ont été réalisés dans le développement d'agonistes de substitution qui ne sont structurellement pas liés aux ligands natifs11,12. Malgré ces progrès récents, il reste un grand besoin non satisfait de méthodes plus robustes et polyvalentes pour concevoir des protéines thérapeutiques avec la stabilité physicochimique et la pharmacocinétique souhaitées.

Les peptides macrocycliques sont apparus comme une nouvelle classe prometteuse de candidats-médicaments dotés d'un certain nombre de caractéristiques souhaitables, telles que l'affinité et la spécificité de liaison de type anticorps13,14, la capacité de cibler des espaces chimiques uniques15,16,17,18 et une découverte efficace grâce à la fois à une conception rationnelle/informatique et à un affichage in vitro18,19,20,21. En général, les peptides macrocycliques présentent de plus grandes affinités pour les cibles que les peptides linéaires en raison de leurs structures cycliques contraintes. Une possibilité intrigante d'étendre l'applicabilité de ces peptides macrocycliques consiste à les « greffer » sur des échafaudages protéiques pour permettre des combinaisons fonctionnelles de peptides et de protéines18,22,23,24,25,26. Cependant, la greffe de peptides identifiés de novo sur des boucles protéiques a été difficile en raison du mauvais repliement potentiel du peptide greffé et de la protéine hôte26.

Le développement du système RaPID (découverte intégrée de peptides non standard aléatoires), qui intègre l'affichage de l'ARN messager et la reprogrammation du code génétique, a permis la découverte de peptides macrocycliques cyclisés à base de thioéther avec une spécificité de liaison exquise contre les protéines cibles16,17,18. Dans des études antérieures, nous avons montré que les séquences pharmacophores dérivées de RaPID peuvent être facilement implantées sur des boucles de protéines exposées à la surface et maintenir les deux fonctions du peptide invité et de la protéine hôte, que nous avons appelées « greffage lasso »27,28,29. La compatibilité de greffage exceptionnelle observée est probablement due à la propriété intrinsèque des motifs pharmacophores à s'auto-plier dans une conformation de liaison à la cible similaire au macrocycle parental, même dans le contexte d'une structure en boucle non apparentée des protéines d'échafaudage18,30.

Dans cette étude, nous tirons parti des propriétés d'échafaudage souhaitables du fragment Fc, de sa longue demi-vie, de sa polyvalence en combinaison avec Fab5,6,31,32 et de sa facilité de production pour montrer la faisabilité et l'application du lasso-greffage. En utilisant le Fc comme échafaudage, nous avons généré des agonistes des récepteurs Met qui se caractérisent par une demi-vie et une pénétrance BBB nettement améliorées.

Met est un récepteur tyrosine kinase activé lors de la dimérisation déclenchée par son ligand, le facteur de croissance des hépatocytes (HGF). Met-HGF est impliqué de manière centrale dans la morphogenèse au cours du développement, la réparation des plaies et l'homéostasie des organes en stimulant la croissance, la survie et la migration des cellules33,34. La protéine HGF recombinante présente une efficacité thérapeutique dans des modèles précliniques34,35 et chez des patients atteints de maladies spécifiques36,37. Cependant, sa courte demi-vie et son incapacité à être délivrée au-delà de la BHE ont longtemps limité son potentiel dans les applications médicales38,39. Pour remédier à ces lacunes, nous avons inséré par lasso-greffage la séquence pharmacophore linéarisée d'aMD4 ou d'aMD5, deux peptides macrocycliques qui se lient à l'ectodomaine de Met40 dans chacune des huit boucles de Fc (Fig. 1a). Ces deux séries de fragments Fc greffés aMD4 ou aMD5 (ci-après respectivement Fc(aMD4) et Fc(aMD5), chacune affichant deux liants Met à moins de 31–42 Å l'un de l'autre, ont le potentiel de rapprocher deux récepteurs Met à la surface cellulaire. Les niveaux d'expression de Fc (aMD4) et Fc (aMD5) dans les cellules Expi293F étaient similaires à ceux du Fc témoin, à l'exception de Fc (aMD5) T3 (Extended Data Fig. 1), ce qui suggère que la greffe de lasso préservait généralement l'expression élevée de Fc.

a, les séquences pharmacophores des liants Met (aMD4 ou aMD5 ; représentées en rouge) ont été insérées dans les boucles (T1 à B3 ; colorées) de la protéine IgG1 Fc humaine (PDB ID : 1h3w). Les séquences d'acides aminés de Fc, les peptides greffés et les sites de greffage sont présentés à droite. b, c, activation de Met cellulaire par Fc greffé aMD4 (Fc(aMD4)) (b) ou Fc greffé aMD5 (Fc(aMD5)) (c). Les cellules EHMES-1 ont été traitées avec des variants Fc (colorés) ou des peptides dimères (gris). L'activation cellulaire de Met a été quantifiée in situ avec un anticorps anti-phospho-Met (Tyr1234/1235). Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± sem (n = 6 expériences indépendantes) en pourcentage de phospho-Met par rapport à la phosphorylation maximale de Met induite par 1,1 nM de HGF. À gauche : T1, T2 et T3. Milieu : M2 et M3. À droite : B1, B2 et B3.

Données source

L'activation de Met cellulaire par Fc(aMD4) ou Fc(aMD5) purifié dépendait fortement du site de greffe (Fig. 1b, c), où B3 était le site optimal pour aMD4 (Fig. 1b). Nos analyses montrent que Fc(aMD4)B3 a activé Met avec une concentration effective demi-maximale (CE50) comparable à celle du peptide aMD4-dimère non greffé (CE50 : 4,5 ± 0,2 nM vs 5,1 ± 0,6 nM, respectivement), et une activation maximale légèrement réduite par rapport à la phosphorylation induite par HGF (74,8 % ± 0,4 % vs 101,3 % ± 0,1 %, respectivement). En revanche, le greffage d'aMD4 dans d'autres boucles a entraîné une activation de Met plus faible par rapport au peptide aMD4-dimère. Dans le cas d'aMD5, B1 était le meilleur site de greffe, où Fc(aMD5)B1 activait Met avec une EC50 3,7 fois supérieure à celle du peptide dimère aMD5 non greffé, et une activation maximale légèrement inférieure (EC50 : 16,6 ± 1,6 nM vs 4,5 ± 0,2 nM, respectivement ; activation maximale : 76,2 % ± 1,4 % vs 105,0 % ± 4,2 %, respectivement ; figure 1c). Le greffage d'aMD5 dans d'autres boucles réduisait ou supprimait l'activation de Met. Notamment, les activités agonistes du Fc greffé au lasso étaient bien corrélées avec leurs forces de liaison à la surface cellulaire Met (Fig. 1a supplémentaire) ou au fragment d'ectodomaine Met (MetECD) (Données étendues Fig. 2 et Fig. 1b supplémentaire), indiquant que leurs efficacités sont déterminées en grande partie par leur affinité pour Met. La différence de dépendance au site de greffe des deux peptides est probablement due aux effets stériques imposés par la différence de leur site de liaison sur l'ectodomaine Met et leurs arrangements spatiaux divergents dans la structure Fc (Fig. 2 supplémentaire).

Pour améliorer l'activité agoniste, nous avons ajouté un résidu Cys à chaque extrémité de la séquence aMD4 pour favoriser une conformation macrocyclique étroitement fermée via une liaison disulfure (Fig. 2a et Fig. 3 supplémentaire). Les dérivés à liaison disulfure aMD4 (ci-après préfixés par 'ds') à T1 et B3 ont montré une activation Met maximale supérieure à celle du témoin (T1, P = 0, 039; B3, P <0, 0001), alors qu'aucun effet n'a été observé dans les valeurs EC50 (Fig. 3f supplémentaire) et constante de dissociation (KD) de la liaison MetECD (Données étendues Fig. 2). En revanche, dsB2 n'a montré aucune amélioration de l'activité agoniste, de l'activation maximale ou des valeurs EC50 (Fig. 3f supplémentaire), ce qui suggère que l'affinité Met réduite après la greffe dans ces deux sites n'était pas due à une conformation sous-optimale du motif peptidique greffé en soi. Cela a été confirmé par les conformations similaires de aMD4 ou aMD5 lorsqu'elles sont greffées en position B1 ou B3 (Fig. 2 supplémentaire).

a, activation cellulaire de Met, mesurée par phospho-Met (Tyr1234/1235), induite par Fc(aMD4)B3, Fc(aMD4ds)B3 et HGF dans des cellules EHMES-1. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± sem (n = 3 expériences indépendantes). b–g, la réponse hépatocytaire induite par le Fc(aMD4)B3 est comparable à celle induite par le HGF. b, Signalisation cellulaire dans les hépatocytes humains traités avec HGF, Fc(aMD4)B3 ou Fc contrôle (100 nM). Les lysats ont été analysés par western blot. c, réseaux de Phospho-récepteur tyrosine kinase montrant la sélectivité de Fc(aMD4)B3 pour Met. Des hépatocytes humains ont été stimulés avec HGF, Fc(aMD4)B3 ou Fc. d – g, Profils d'expression génique similaires dans les sphéroïdes d'hépatocytes humains primaires induits par le Fc (aMD4) B3 et le HGF. d, Schéma d'induction et de stimulation de sphéroïdes hépatocytaires par HGF ou Fc(aMD4)B3. Une image représentative est affichée. Barre d'échelle, 200 µm. e, Un nuage de points montrant la corrélation entre les changements d'expression génique induits par HGF et Fc (aMD4) B3 à 24 h. La ligne pointillée bleue indique la ligne de régression. f, carte thermique des DEG de sphéroïdes d'hépatocytes traités au HGF ou au Fc (aMD4) B3 par rapport aux sphéroïdes d'hépatocytes non traités (n = 2 par groupe, taux de fausse découverte (FDR) <0, 05, Benjamini – Hochberg, bilatéral). g, Termes GO considérablement enrichis représentatifs et leurs cartes thermiques pour les DEG de sphéroïdes d'hépatocytes traités au HGF ou au Fc (aMD4) B3 par rapport aux témoins non traités (24 h, FDR <0, 05, Benjamini – Hochberg, recto verso).

Données source

Les réponses cellulaires induites par le Fc(aMD4)B3 dans les cellules EHMES-1 ou dans les hépatocytes étaient très comparables à celles du HGF (Fig. 2 et Extended Data Fig. 3). Fc (aMD4) B3 à 1 nM a induit la phosphorylation de Met à Y1234/1235 et a activé la signalisation en aval ultérieure avec la phosphorylation de Akt et Erk1/2 à des niveaux comparables à ceux induits par HGF (Fig. 2b et Fig. 4 supplémentaire). Les niveaux de phosphorylation induits par Fc (aMD4) B3 et HGF au niveau de trois résidus tyrosine différents de Met, ainsi que la cinétique d'induction de la phosphorylation de Met, Akt et Erk1 / 2, étaient comparables (Extended Data Fig. 3). La sélectivité de Fc (aMD4) B3 pour Met a été confirmée par une étude de la phosphorylation de la tyrosine de 49 récepteurs (Fig. 2c et Fig. 5 supplémentaire). Les modifications de l'expression génique induites par le Fc (aMD4) B3 ou le HGF ont été examinées dans la culture primaire de sphéroïdes d'hépatocytes humains par ARN-seq (Fig. 2d – g). Un nuage de points montre la corrélation des changements d'expression génique induits par HGF et Fc (aMD4) B3 par rapport aux sphéroïdes non traités (Fig. 2e). Enfin, une carte thermique des gènes différentiellement exprimés (DEG) par rapport aux sphéroïdes non traités indique que le Fc (aMD4) B3 et le HGF ont modifié de manière similaire l'expression de plus de 2 000 transcrits (Fig. 2f), avec un enrichissement significatif des termes d'ontologie génique (GO) liés à la cicatrisation des plaies et aux fonctions hépatiques (Fig. 2g).

Comme les peptides générés de novo pourraient se lier de manière différentielle aux récepteurs cibles d'une manière complètement différente de celle des ligands natifs, nous pourrions théoriquement générer des agonistes qui ne concurrencent pas les ligands natifs ou sont capables d'activer des récepteurs mutés dépourvus de liaison au ligand. Pour étudier ce potentiel, nous avons d'abord cartographié le site de liaison putatif Fc (aMD4) B3 (indiqué en rouge sur la figure 3a) à l'aide de fragments chimériques de MetECD qui fusionnaient de manière variable le MetECD humain et de souris (Extended Data Fig. 4), exploitant la spécificité de aMD4 pour Met40 humain. Le site de liaison putatif est cartographié sur la face inférieure du domaine Sema de Met, qui ne chevauche pas le site de liaison HGF41, expliquant ainsi pourquoi le peptide aMD4 n'entre pas en compétition avec l'activation Met induite par HGF40.

a, Résidus essentiels (rouge) et auxiliaires (orange) pour la liaison de Fc(aMD4)B3 dans le domaine Sema (PDB ID : 1shy). Le domaine SP de HGF est représenté en jaune. Met la structure de l'ectodomaine à partir des modèles prédits (PDI ID : 1ux3 pour Sema à IPT1, 2cew pour IPT2 à IPT4). b, Formation de dimères Met par Fc(aMD4) in vitro. Les complexes entre MetECD et Fc (aMD4) ou le Fc témoin ont été réticulés par BS3 et analysés par SDS – PAGE dans des conditions non réductrices et colorés à l'argent. c – f, images HS-AFM séquentielles représentatives de Fc (aMD4) B3 ( c ), MetECD ( d ) et complexes 2: 1 de dimère Met induits par Fc (aMD4) B3 ( e, f ). Les interprétations schématiques des images HS-AFM sont présentées en e et f (panneaux supérieurs). Les pointes de flèche indiquent le domaine Sema. La purification du complexe est illustrée dans les données étendues de la figure 5c. Au moins cinq molécules ou complexes ont été observés pour chaque échantillon. Les couleurs (du noir au blanc) correspondent aux hauteurs croissantes des molécules. Barres d'échelle, 20 nm. Ces expériences ont été répétées indépendamment deux fois, donnant des résultats comparables.

Nous avons ensuite examiné la structure du dimère Met induit par Fc(aMD4). Les complexes entre MetECD et Fc (aMD4) ont été stabilisés par réticulation à l'aide de bis (sulfosuccinimidyl) subérate (BS3) et analysés par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide (SDS – PAGE) (Fig. 3b et Extended Data Fig. 5a, b). Les résultats ont indiqué la formation de complexes entre MetECD et Fc(aMD4) en stoechiométrie 1:1 ou 2:1. L'efficacité relative de divers Fc (aMD4) dans la formation d'un complexe de signalisation 2: 1 était de l'ordre de B3> B1> B2, ce qui était bien corrélé avec leur capacité à activer la Met cellulaire. Le complexe 2: 1 réticulé par BS3 de MetECD et Fc (aMD4) B3 a été purifié par chromatographie d'exclusion de taille (données étendues Fig. 5c) et soumis à un examen d'une seule molécule par microscopie à force atomique à grande vitesse (HS-AFM) 42, avec Fc et MetECD comme témoins (Fig. 3c – f et vidéos supplémentaires 1–4). Sur HS-AFM, MetECD a montré un domaine Sema globulaire et des domaines de tige de type Ig, plexines, facteurs de transcription (IPT), le positionnement relatif de chaque domaine IPT étant flexible (Fig. 3d et vidéo supplémentaire 2). Le Fc(aMD4)B3 s'est lié à la face inférieure du domaine Sema et a ponté deux molécules Met tout en faisant pulvériser les domaines de tige IPT (Fig. 3e et Vidéo supplémentaire 3) ou attachés (Fig. 3f et Vidéo supplémentaire 4). La flexibilité des domaines IPT permet probablement la bonne association des domaines kinases intracellulaires de deux molécules Met, cette association étant essentielle pour l'activation de Met33,34. Ces résultats montrent que si le Fc(aMD4)B3 se lie à Met sur un site différent de celui de l'HGF, son recrutement de deux récepteurs Met très proches lui permet d'activer Met dans la même mesure que l'HGF.

Les longues demi-vies du Fc et des anticorps sont principalement maintenues par leur liaison au FcRn43,44,45,46. En tant que tel, nous avons sélectivement greffé au lasso dans des emplacements de boucle éloignés du site de liaison FcRn (Fig. 4a). En conséquence, notre analyse de la cinétique de liaison entre Fc (aMD4) et FcRn immobilisé a montré que la greffe de lasso dans la plupart des boucles n'affectait pas l'affinité de Fc à FcRn, bien que Fc (aMD4) T2 et M2 présentaient des valeurs de KD légèrement plus élevées que le contrôle Fc (Fig. 4b et Extended Data Fig. 6). Ceci suggère que le lasso-greffage sur Fc préserve l'affinité de Fc à FcRn.

a, les boucles à insertion de peptide (T1 à B3) dans Fc (gris) sont conçues loin du site de liaison au FcRn (orange) et à la β2-microglobuline (β2M, jaune) (PDB ID : 4N0U). b, valeurs KD de Fc et Fc(aMD4) à FcRn/β2M déterminées par résonance plasmonique de surface. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± sem (doublons de 3 concentrations d'analytes ; test t bilatéral non apparié). c,d, Fc(aMD4)B3 a montré une longue demi-vie sérique chez la souris. Des souris C57BL/6 de type sauvage (c) ou des souris mFcRn-/-hFcRn+ (d) ont reçu une seule injection d'une quantité équimolaire par kg de Fc (0,7 mg kg-1), Fc(aMD4)B3 (0,74 mg kg-1) ou HGF (1,0 mg kg-1) via la veine caudale, et les concentrations sériques ont été déterminées par ELISA. Les résultats sont présentés sous forme de valeurs individuelles (n = 6 souris par groupe) (c) ou moyenne ± sem (d) (n = 10 souris par groupe). Pour HGF, certains échantillons étaient en dessous de la limite de détection. e–j, Activité in vivo du Fc(aMD4)B3 chez des souris avec foie humanisé (souris PXB). e, schématique. f, g, synthèse d'ADN réplicatif. f, images représentatives montrant la coloration de BrdU dans le foie de souris traitées au Fc(aMD4)B3 ou au PBS. Barre d'échelle, 100 µm. g, pourcentage de cellules BrdU+ dans le foie. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± sem (n = 4 souris par groupe ; test t bilatéral non apparié). h–j, Profils d'expression génique. h, carte thermique des DEG entre les foies de souris PXB traités au Fc (aMD4) B3 et traités au PBS (n = 4 souris par groupe, FDR <0, 01, Benjamini – Hochberg, recto-verso). i,j, termes GO enrichis représentatifs en termes d'enrichissement en plis (i) ou de nombre de gènes (j) pour les DEG de foies traités au Fc(aMD4)B3 par rapport au témoin traité au PBS (FDR < 0,01, Benjamini – Hochberg, bilatéral).

Données source

Nous avons ensuite évalué la demi-vie sérique du Fc (aMD4) B3 par rapport à celles du Fc et du HGF témoins chez des souris de type sauvage après une seule administration intraveineuse (iv) à une quantité équimolaire par kg (Fig. 4c). La concentration sérique de HGF a diminué à moins de 0,01 nM en 1 h, ce qui a été incapable d'activer Met. En revanche, le Fc(aMD4)B3 a montré une demi-vie prolongée comparable à celle du Fc témoin (Fig. 4c). Pour déterminer avec précision la pharmacocinétique de nos variants humains à base de Fc, nous avons mesuré les demi-vies sériques du Fc(aMD4)B3 et du Fc témoin chez des souris mFcRn−/−hFcRn+47 (Fig. 4d). La demi-vie sérique du Fc(aMD4)B3 chez ces souris était de 49,4 h et comparable à celle du Fc témoin (46,6 h). La concentration sérique de Fc (aMD4) B3 est restée supérieure à 1 nM, la concentration minimale pour activer Met (Fig. 2a, b), jusqu'à 200 h après une seule administration iv à 0, 74 mg kg -1 (Fig. 4d).

L'activité in vivo du Fc(aMD4)B3 a ensuite été examinée en utilisant des souris chimériques transplantées avec des hépatocytes humains avec environ 80 % des hépatocytes humanisés (souris PXB)48, car le Fc(aMD4)B3 est incapable d'activer la Met40 murine. Nous avons d'abord confirmé la demi-vie sérique prolongée du Fc (aMD4) B3 chez les souris PXB après une seule injection iv ou sous-cutanée (sc) à 5 mg kg -1 (Fig. 6 supplémentaire). Par la suite, la prolifération et l'expression génique des hépatocytes humains 46 h après une seule injection sous-cutanée de Fc (aMD4) B3 ou de PBS chez des souris PXB (Fig. 4e – j) ont été analysées. Le Fc (aMD4) B3 a augmenté de manière significative la synthèse d'ADN réplicatif des hépatocytes par rapport à ceux des souris témoins traitées avec du PBS (3, 73% ± 0, 31% contre 0, 37% ± 0, 07%, respectivement, P <0, 0001) (Fig. 4f, g). Une carte thermique des DEG entre les foies traités au Fc (aMD4) B3 et au PBS a indiqué que le Fc (aMD4) B3 modifiait l'expression de plus de 3 200 transcrits (Fig. 4h). Les termes GO considérablement enrichis parmi eux étaient principalement impliqués dans la réplication de l'ADN mitotique / le cycle cellulaire et les processus métaboliques (Fig. 4i, j). Pris ensemble, ces résultats montrent que le lasso-greffage a généré un Fc activant Met qui est bioactif in vivo, avec une demi-vie nettement améliorée qui est comparable à celle du Fc non modifié.

Il a été rapporté que l'activation de Met induite par HGF exerce des effets neuroprotecteurs bénéfiques dans des modèles précliniques d'ischémie cérébrale, de lésions de la moelle épinière et de pathologies neurologiques, telles que la maladie d'Alzheimer, la sclérose latérale amyotrophique et la sclérose en plaques35. Conformément à des études antérieures, nous avons confirmé que Met est exprimé dans les neurones du cerveau de souris (Fig. 7 supplémentaire). Pour générer des agonistes Met capables de traverser la BHE, nous avons appliqué une greffe lasso d'aMD4 sur le Fc de l'anticorps anti-souris TfR (mTfR)49 en configuration simple ou double Fab (sTfR(aMD4) et dTfR(aMD4), respectivement) (Fig. 5a, b et Fig. 8 supplémentaires). La greffe de lasso n'a pas modifié de manière significative l'affinité précédemment rapportée 9, 10 de ces anticorps pour mTfR, ce qui suggère que l'affinité Fab est largement préservée (Fig. 5c). En revanche, sTfR (aMD4) et dTfR (aMD4) ont montré une activation réduite de Met par rapport à Fc (aMD4), avec une réduction de 9, 6 et 18, 7 fois des valeurs de CE50 (20, 2 ± 3, 4 nM contre 39, 2 ± 22, 3 nM contre 2, 1 ± 0, 2 nM, respectivement) (Fig. 5d). Cela était peut-être dû à la présence de grands bras Fab sur sTfR(aMD4) et dTfR(aMD4), qui peuvent avoir interféré avec leur liaison et/ou la dimérisation de Met à la surface cellulaire.

a, représentations schématiques de Fc(aMD4), dTfR(aMD4) et sTfR(aMD4). Tous les variants ont été greffés avec aMD4ds au niveau de la boucle B3 de l'IgG humaine Fc. Le Fab du récepteur de la transferrine anti-souris de rat a été fusionné avec le Fc(aMD4). b, SDS-PAGE des variants purifiés. c, Lasso-greffe d'aMD4 sur des anticorps anti-TfR a conservé l'affinité pour TfR. Les valeurs apparentes de KD (en nM) de Fc(aMD4), sTfR(aMD4) et dTfR(aMD4) au TfR de souris (mTfR) ont été déterminées par ELISA et sont présentées sous forme de moyenne ± sd (n = 3 expériences indépendantes). d, activation de Met cellulaire par des anticorps anti-TfR greffés à aMD4. Les cellules EHMES-1 ont été traitées avec Fc(aMD4), sTfR(aMD4) ou dTfR(aMD4). L'activation cellulaire de Met a été quantifiée in situ avec un anticorps anti-phospho-Met (Tyr1234/1235) et présentée sous forme de moyenne ± sd (n = 3 expériences indépendantes). Les valeurs EC50 (en nM) sont indiquées. e – j, pénétration dans la BBB des anticorps anti-TfR greffés aMD4. Schéma (e), concentration cérébrale (f), pourcentage de dose injectée par gramme de cerveau (g), concentration sérique (h) et rapport cerveau/sérum (i) à 24 h après une seule injection de Fc(aMD4), sTfR(aMD4) ou dTfR(aMD4) en quantité équimolaire par kg (12, 20 et 26,5 mg kg-1, respectivement) via la veine caudale. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± sem (n = 4 souris par groupe; test t bilatéral non apparié). j, Images représentatives de la coloration immunohistochimique de coupes de cerveau de souris à 24 h après une seule injection de Fc(aMD4), sTfR(aMD4) ou dTfR(aMD4) via la veine caudale. Notez la large coloration de sTfR (aMD4) dans le parenchyme cérébral et la localisation autour des corps cellulaires neuronaux NeuN-positifs. La coloration pour dTfR(aMD4) était plus importante dans les cellules endothéliales que dans les corps cellulaires neuronaux. Barres d'échelle, 50 µm.

Données source

Enfin, nous avons examiné la pénétration de la BBB des trois variantes greffées d'aMD4 chez des souris de type sauvage après une seule administration iv à des doses thérapeutiquement pertinentes des protéines à une quantité équimolaire par kg (Fig. 5e – j). Leurs concentrations dans les cerveaux ou le sérum perfusés au PBS 24 h après l'injection iv ont été déterminées par ELISA pour l'IgG Fc humaine. Parmi les trois variantes, sTfR (aMD4) a montré le pourcentage le plus élevé de dose injectée par gramme de cerveau (0, 96% ± 0, 07%), le rapport cerveau / sérum (8, 3% ± 0, 7%), ainsi que la concentration cérébrale la plus élevée ( 10, 7 ± 1, 2 nM) (Fig. 5f – i), ce qui est suffisant pour l'activation de Met (Fig. 5d). Ces résultats sont conformes aux rapports précédents sur l'accumulation d'anticorps anti-TfR de faible affinité dans le cerveau9,10,50. En comparaison, ces valeurs étaient significativement plus faibles pour dTfR (aMD4) et presque négligeables pour Fc (aMD4) (Fig. 5f – i). Concordant avec la concentration cérébrale plus élevée déterminée par ELISA, sTfR (aMD4) a montré une coloration parenchymateuse importante co-localisée avec NeuN, GFAP et Iba1, indiquant sa distribution aux neurones, aux astrocytes et à la microglie, respectivement (Fig. 5j (au milieu à droite) et Supplémentaire Fig. 9). En comparaison, le dTfR (aMD4) a montré une coloration neuronale moins étendue et une coloration plus endothéliale (Fig. 5j (à droite)), conformément aux rapports précédents sur l'accumulation d'anticorps anti-TfR de haute affinité dans les cellules endothéliales du cerveau9,10. Enfin, Fc (aMD4) était indétectable dans le parenchyme cérébral (Fig. 5j (milieu gauche)). Une évaluation plus approfondie des profils pharmacocinétiques détaillés, y compris l'évolution dans le temps, sera nécessaire pour une future évaluation thérapeutique de sTfR(aMD4) dans des modèles précliniques. Prises ensemble, ces observations ont montré que nous avons généré des agonistes Met pénétrant dans la BBB en greffant au lasso un peptide macrocyclique se liant à Met sur le Fc de l'anticorps anti-mTfR.

Le greffage de peptides identifiés de novo pour améliorer leur stabilité et leur biodisponibilité a été tenté sur une variété d'échafaudages23,24,25,26. Ces études antérieures ont révélé qu'une greffe réussie dépend fortement de la combinaison et de la compatibilité entre les peptides greffés et les protéines d'échafaudage25,26. En tant que telle, la sélection de la protéine d'échafaudage est une considération clé, car elle détermine le succès de la greffe de peptides tout en conférant des propriétés souhaitables telles que la stabilité métabolique et la perméabilité cellulaire aux produits d'ingénierie24,25,26. Pour répondre à ce large éventail de caractéristiques souhaitables, des peptides et des miniprotéines stabilisés au disulfure ont été conçus pour agir comme des échafaudages spécialisés pour le greffage de peptides23,24,25,26. Cependant, ces échafaudages spécialisés sont de petites protéines non humaines sans bioactivité particulière. Bien que les protéines humaines naturelles soient des échafaudages souhaitables pour la greffe de peptides, il y a eu jusqu'à présent des tentatives très limitées pour greffer des peptides identifiés de novo sur des échafaudages humains naturels. L'une des principales raisons derrière cela est que la greffe de peptides synthétiques identifiés de novo dans un domaine replié indépendamment d'un échafaudage naturel entraînerait souvent le mauvais repliement et l'inactivation des deux entités. Il est donc remarquable que nos données indiquent jusqu'à présent que le greffage fonctionnel de peptides macrocycliques identifiés de novo dans les boucles protéiques des échafaudages naturels est beaucoup plus réalisable que prévu27,28,29.

En tant qu'échafaudage protéique, le Fc est hautement souhaitable en raison de sa forte expression, de sa facilité de fabrication, de sa longue demi-vie et de sa compatibilité Fab5,6,31,32. Dans cette étude, nous rapportons que le greffage lasso de Fc avec des peptides macrocycliques a donné des agonistes des récepteurs Met avec une demi-vie prolongée et une pénétration de la BHE. Notre application de lasso-greffage sur Fc a révélé trois points forts de cette approche : premièrement, le lasso-greffage a préservé les caractéristiques biochimiques globales de Fc en termes de niveau d'expression, d'affinité FcRn et de compatibilité Fab. Deuxièmement, le peptide macrocyclique greffé au lasso a largement conservé la conformation macrocyclique parentale même sans liaison disulfure. Troisièmement, il existe un large choix de positions d'insertion appropriées dans Fc. Notre étude a en outre montré que l'affinité cible des peptides greffés dépend du site. Par exemple, les boucles en T étaient moins efficaces dans notre étude, probablement en raison de la présence d'une région charnière N-terminale qui pourrait interférer avec la liaison des peptides greffés à la protéine cible, Met. Pourtant, ces boucles ont agi comme des positions de greffage appropriées pour d'autres liants de récepteurs27,29. Malgré cela, la compatibilité de greffe robuste entre les peptides macrocycliques et Fc, en combinaison avec un large choix de positions d'insertion, fait du lasso-greffage une approche particulièrement efficace de l'ingénierie Fc.

Une implication importante de nos découvertes est que les échafaudages protéiques greffés au lasso avec des propriétés spécifiques peuvent servir de cadre pour concevoir des agonistes de récepteurs concepteurs avec les propriétés souhaitées en fonction du choix des échafaudages protéiques. À titre de démonstration, nous avons généré des agonistes perméables à la BBB en greffant au lasso un anticorps anti-TfR, tirant ainsi parti d'une technique établie de perméation à la BBB8,9,10. À l'heure actuelle, plusieurs efforts sont déployés pour développer des anticorps de fusion anti-TfR Fab dotés de propriétés bloquantes, mais seuls quelques-uns tentent de développer des anticorps agonistes51. La greffe de lasso pourrait être utilisée pour concevoir des anticorps agonistes imprégnant la BBB, en plus des antagonistes. En outre, un inconvénient majeur des anticorps actuels imprégnant la BBB est que, en raison de leur faible rapport cerveau-sérum et de leur longue demi-vie en circulation, les concentrations systémiques dépassent souvent la plage souhaitée pendant de longues périodes. Cela pourrait provoquer une néo-immunogénicité indésirable ou des effets secondaires, en particulier si la molécule ciblée est fonctionnellement importante dans d'autres tissus. Avec le lasso-greffage, cela pourrait être évité en greffant des peptides fonctionnels directement dans des protéines d'échafaudage à demi-vie courte, comme le Fab anti-TfR.

Contrairement aux méthodes existantes qui améliorent la pharmacocinétique des protéines thérapeutiques en modifiant la protéine, le lasso-greffage confère de nouvelles fonctions dérivées de petits peptides à des échafaudages protéiques bien compris27,28,29, évitant ainsi les pièges potentiels tels qu'une activité biologique réduite, des caractéristiques protéiques défavorables pour la fabrication ou une néo-immunogénicité résultant de la fusion de protéines ou du poly(éthylène glycol)5,6,7. Bien que Fc constitue un excellent échafaudage en raison de sa propriété immunosuppressive52, l'immunogénicité, l'innocuité et l'efficacité des protéines greffées au lasso attendent une évaluation future dans le cadre du développement de médicaments. Dans le même ordre d'idées, l'HGF a montré des efficacités thérapeutiques dans des modèles précliniques de diverses maladies telles que la stéatohépatite non alcoolique53,54 ou des pathologies neurologiques35,37. Les avantages thérapeutiques des agonistes Met greffés au lasso générés dans cette étude devraient également être évalués plus avant dans des modèles de maladie.

Compte tenu des progrès rapides des peptides macrocycliques bioactifs et compatibles avec la greffe, la greffe de lasso est très prometteuse pour la génération de protéines thérapeutiques de conception avec la stabilité physicochimique et la pharmacocinétique souhaitées, ainsi que pour l'ingénierie de protéines multifonctionnelles et d'anticorps.

Pour concevoir la protéine Fc à greffe de peptide, la protéine Fc a été structurellement inspectée pour trouver un point d'insertion approprié où la distance approximative entre les deux résidus de point d'ancrage situés dans une boucle exposée était inférieure à 7 Å. Pour la construction du Fc greffé de peptide macrocyclique de contrôle ou de liaison Met (aMD4 ou aMD5), le Fc IgG1 humain (résidus 104–330, Uni-Prot P01857) a été utilisé sans aucune étiquette. La séquence interne de aMD4 ou aMD5 annexée avec ou sans Cys et deux résidus espaceurs de Gly aux deux extrémités ont été insérés dans ces sites identifiés (T1 à B3). Pour la construction d'anticorps anti-TfR de souris avec insertion de aMD4ds au site B3, le fragment Fab d'un anticorps monoclonal de rat anti-TfR de souris (clone 8D3)49 a été utilisé. Le fragment VH à CH1 de 8D3 a été fusionné à l'extrémité N-terminale de Fc(aMD4) pour donner la chaîne lourde (HC) de dTfR(aMD4). Le fragment VL à CL de 8D3 a été utilisé pour produire la chaîne légère (LC). Pour la construction de sTfR(aMD4), une étiquette drapeau a été ajoutée à l'extrémité N-terminale de Fc(aMD4). Les séquences d'acides aminés utilisées pour s / dTfR (aMD4) peuvent être trouvées dans la Fig. 8 supplémentaire. Toutes les constructions d'expression ont été réalisées à l'aide d'un squelette basé sur pcDNA3.1 avec un peptide signal approprié et la région codante de toutes les constructions d'expression a été vérifiée par séquençage d'ADN. Les expressions protéiques ont été réalisées à l'aide du système d'expression Expi293 (Thermo Fisher). Les protéines sécrétées ont été purifiées sur une colonne HiTrap Protein A HP (Cytiva) en utilisant une élution avec un tampon citrate acide-citrate de sodium 0,1 M (pH 3,5), suivie d'une neutralisation, d'une dialyse contre une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et d'une chromatographie d'exclusion de taille sur une colonne Superdex 200 Augmentation 10/300GL (Cytiva) équilibrée avec du PBS. L'analyse SDS – PAGE et la pureté des variants Fc purifiés utilisés dans le test peuvent être trouvées dans la Fig. 10 supplémentaire. (aMD4). Le sTfR(aMD4) a été purifié à partir des deux derniers composants par purification séquentielle d'affinité anti-Flag et chromatographie d'exclusion de taille sur une colonne Superdex 200 Augmentation 10/300GL équilibrée avec du PBS.

Des cellules de mésothéliome humain EHMES-1 ont été ensemencées à 8 000 cellules par puits dans une plaque µClear noire à 96 puits (Greiner Bio-One) et cultivées dans du milieu RPMI1640 additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) pendant 24 h. Les cellules ont été stimulées avec chaque protéine dans un milieu RPMI1640 additionné de 10 % de FBS pendant 10 min ou le temps indiqué, lavées avec du PBS glacé, fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS pendant 30 min, lavées avec du PBS et bloquées avec 5 % de sérum de chèvre et 0,02 % de Triton X-100 dans du PBS pendant 30 min. La phosphorylation de Met, Akt ou Erk1/2 a été détectée à l'aide d'un anticorps anti-phospho-Met (Tyr1234/1235) (dilution 1:1 000, D26, Cell Signaling Technologies), Akt phosphorylé (S473) (dilution 1:1 000, D9E, Cell Signaling Technology) ou Erk1/2 phosphorylé (T202/Y204) (dilution 1:1 000, D13 .14.4E, Cell Signaling Technology) et un anticorps de chèvre anti-lapin conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) (dilution 1:1 000, Dako). Ensuite, la chimiluminescence développée avec le réactif ImmunoStar LD (Wako) a été mesurée à l'aide d'un lecteur de plaque ARVO MX (Perkin Elmer).

La liaison des protéines Fc greffées avec des peptides aux cellules CHO Met-knockout et aux cellules CHO reconstituées Met a été détectée par cytométrie en flux. Les cellules ont été détachées des boîtes par un bref traitement avec 0, 25% de trypsine et 1 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique, étalées à 200 000 cellules par puits et incubées avec des protéines Fc greffées de peptides diluées à 10 mg ml-1 dans 100 ml de milieu F-12 de Ham contenant 5% FBS sur glace pendant 1,5 h. Après deux lavages avec du PBS glacé, les cellules ont été incubées avec des IgG anti-humaines de chèvre marquées à l'Alexa Fluor 488 (dilution 1:400 dans 100 µl de milieu F-12 de Ham contenant 5 % de FBS, Thermo Fisher, A11013) sur de la glace pendant 30 min, puis analysées sur un système EC800 (Sony). La porte sur la diffusion vers l'avant par rapport à la diffusion latérale a été définie pour inclure toutes les populations de cellules, mais à l'exclusion des débris et des cellules mortes, comme indiqué dans la Fig. 11 supplémentaire. Les données ont été analysées avec le logiciel FlowJo (Tomy Digital Biology).

Le fragment d'ectodomaine de Met humain (MetECD, 1–931) a été fusionné en C-terminal avec une séquence accepteur de biotine (SSLRQILDSQKMEWRSNAGG) et co-exprimé avec une biotine ligase (BirA) dans des cellules Expi293F pour obtenir une biotinylation biosynthétique médiée par BirA et immobilisé sur une puce Series S Biotin CAPture (Cytiva) à une densité de surface d'environ 210 résonance unités (RU). La liaison de Fc et de Fcs greffé avec un peptide a été évaluée en injectant les solutions d'analyte diluées en série à l'aide du tampon courant (HEPES-NaOH 20 mM (pH 7, 5), NaCl 150 mM, Tween 20 à 0, 05%). Les essais ont été réalisés en mode cinétique à cycle unique en utilisant les paramètres suivants : débit de 30 µl min-1, temps de contact de 120 s et temps de dissociation de 300 s. Après chaque essai, la surface a été régénérée en injectant le tampon de régénération (guanidine-HCl 6 M, NaOH 250 mM) jusqu'à ce que la réponse revienne au niveau de base d'origine. Les courbes de liaison ont été obtenues en soustrayant l'UR de la cellule de référence (non immobilisée) de celle de la cellule de mesure (immobilisée avec MetECD) et utilisées pour dériver les valeurs de liaison cinétique. Les données ont été obtenues à l'aide d'un instrument Biacore T200 (Cytiva) à 25 ° C, et les résultats ont été analysés à l'aide du logiciel d'évaluation Biacore T200 v3.2 (Cytiva). Le FcRn/β2M humain biotinylé (ACROBiosystems) a été capturé à la surface de puces revêtues de streptavidine (Cytiva) à 180 ~ 220 RU. Les analytes ont été dilués dans un tampon courant (50 mM de phosphate (pH 6, 0), 150 mM de NaCl, 0, 01% de Tween 20) et injectés à 30 µl min-1 pendant 1 min, suivis d'une dissociation pendant 0, 7 min. Les courbes de liaison ont été obtenues en soustrayant l'UR de la cellule de référence (non immobilisée) de celle de la cellule de mesure (immobilisée avec FcRn/2M) et après la mise à zéro de l'axe, les sensorgrammes ont été adaptés localement à un modèle de liaison Langmuir 1:1. Les données ont été obtenues à l'aide d'un instrument Biacore 3000 (Cytiva) à 25 ° C, et les résultats ont été analysés à l'aide du logiciel BIAevaluation v4.1 (Cytiva).

Les structures du domaine CH3 de Fc avec aMD4 ou aMD5 inséré dans la boucle B1 ou B3 ont été prédites à l'aide de ColabFold et AlphaFold2 dans MMseqs255.

La digestion à la trypsine et l'analyse LC-MS/MS ont été réalisées par KANEKA TECHNO RESEARCH. Cent µg de Fc(aMD4ds)T1 ou Fc(aMD4ds)B3 dans du PBS ont été traités avec du bicarbonate d'ammonium 100 mM (Sigma-Aldrich) contenant de l'urée 8 M (Fujifilm Wako Pure Chemicals). Après dessalement à l'aide d'un appareil Amicon Ultra (MWCO : 10 K, Millipore), 10 µg de chaque protéine ont été digérés avec de la trypsine (Promega) pendant 12 h à 37 °C dans des conditions non réductrices. La réaction a été stoppée par addition d'acide formique. Les échantillons ont été injectés dans un système Nexera X2 UHPLC (Shimadzu corporation) connecté à un système SCIEX TripleTOF 6600 (AB SCIEX) équipé d'une source d'ionisation ESI. Les peptides ont été séparés par chromatographie sur une colonne en phase inverse C18 avec un gradient linéaire de phase mobile A (eau contenant 0,1 % d'acide formique) et de phase mobile B (acétonitrile (Fujifilm Wako Pure Chemicals) contenant 0,1 % d'acide formique). Les données MS et MS/MS ont été collectées en utilisant IDA, mode ions positifs. Les données brutes LC-MS ont été traitées à l'aide du logiciel SCIEX BioPharmaView. Les critères suivants ont été utilisés pour identifier les peptides : la précision de la masse pour le précurseur apparié doit être inférieure à 5 ppm de l'erreur de masse, et le score d'appariement des peptides a été défini sur au moins 3 pour l'identification des peptides.

MetECD (60 nM) et Fc(aMD4)B1/B2/B3 (20 nM) ont été mélangés dans 100 µl de PBS avec 0,01 % de Triton X-100 pendant 1 h. Les échantillons ont été divisés en deux et traités avec 1 mM BS3 (Thermo Fisher) ou laissés non traités pendant 1 h, trempés par 50 mM Tris, soumis à SDS-PAGE (gel 7, 5% ou 3-10%) et colorés à l'argent. Pour l'observation HS-AFM, MetECD (2,6 µM) et Fc(aMD4)B3 (1,3 µM) ont été mélangés dans 100 µl de PBS avec 0,01 % Triton X-100 pendant 1 h, traités avec 1 mM BS3 pendant 1 h, désactivés par 50 mM Tris et analysés par chromatographie d'exclusion stérique sur une colonne Superose 6 Augmentation 10/300GL (Cytiva) equilib évalué avec PBS. Les fractions séparées ont été analysées par SDS-PAGE et colorées avec du bleu brillant de Coomassie. Une seule fraction a été soumise à une analyse HS-AFM.

Les mesures HS-AFM ont été opérées en mode tapotement. La déviation en porte-à-faux a été détectée avec un détecteur de déviation de faisceau optique utilisant un laser infrarouge (IR) (0,7 mW, 780 nm). Le faisceau laser IR a été focalisé sur l'arrière d'un porte-à-faux recouvert d'un film d'or (Olympus, BL-AC10DS-A2) à travers un objectif ×60 (CFI S Plan Fluor ELWD ×60 ; Nikon). La réflexion du laser IR du porte-à-faux a été détectée à l'aide d'une photodiode PIN à deux segments (MPR-1; Graviton). L'amplitude d'oscillation libre était d'environ 1 nm et l'amplitude du point de consigne était d'environ 90 % de l'amplitude libre pour le contrôle par rétroaction du HS-AFM. Pour la sonde AFM, une pointe de carbone amorphe d'une longueur d'environ 500 nm développée par dépôt par faisceau d'électrons a été utilisée. Pour le substrat AFM, une surface de mica traitée avec 0,01 % de 3-aminopropyl-triéthoxysilane (Shin-Etsu Silicone) a été utilisée. Toutes les observations HS-AFM ont été effectuées dans une solution tampon contenant du Tris-HCl 50 mM (pH 7,4) et du NaCl 100 mM à température ambiante.

Des monocouches d'hépatocytes humains primaires dérivés de souris chimériques avec un foie humanisé ont été obtenues auprès de PhoenixBio et cultivées dans des plaques à 12 puits recouvertes de collagène. Les hépatocytes ont été cultivés dans un milieu dHCGM composé de milieu d'Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 10 % de FBS, HEPES 20 mM, NaHCO3 44 mM, des antibiotiques (100 U ml-1 pénicilline G et 100 µg ml-1 streptomycine), 15 µg ml-1 l-proline, 0,25 µg ml-1 insuline, 50 nM dexaméthasone, 5 ng ml-1 facteur de croissance épidermique, 0,1 mM d'acide l-ascorbique et 2 % de diméthylsulfoxyde (tous les suppléments de PhoenixBio).

Des hépatocytes humains cryoconservés ont été obtenus auprès de Gibco. Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits à très faible attachement (Nunclon Sphera, Thermo Fisher) à 1 500 cellules viables par puits, puis centrifugées à 200 × g pendant 2 min. Les cellules ont été ensemencées dans 100 µl de milieu Williams E additionné de GlutaMAX 2 mM, 100 U ml-1 pénicilline, 100 µg ml-1 streptomycine, 4 µg ml-1 insuline, 1 µM dexaméthasone, 15 mM HEPES (pH 7,4) et 10 % de FBS (tous les suppléments de levure orientale). A partir de cinq jours après l'ensemencement, lorsque les sphéroïdes étaient suffisamment compacts, 50% du milieu a été échangé tous les 2 jours avec du milieu Williams E sans sérum additionné de GlutaMAX 2 mM, 100 U ml-1 pénicilline, 100 µg ml-1 streptomycine, 6,25 µg ml-1 insuline, 6,25 µg ml-1 transferrine, 6,25 µg ml-1 acide séléneux, 1,2 5 mg ml-1 BSA, 5,35 µg ml-1 acide linoléique, 100 nM de dexaméthasone et 15 mM HEPES (pH 7,4) (tous les suppléments d'Oriental Yeast). Les sphéroïdes ont été traités dans un milieu sans sérum avec 0, 3 nM de HGF ou 30 nM de Fc (aMD4) B3 les jours 7 et 9. Quarante-huit sphéroïdes ont été collectés pour chaque groupe et soumis à un isolement d'ARN aux jours 8 ou 10.

Les hépatocytes monocouches ont été privés de sérum dans du DMEM avec 0, 2% de BSA pendant 3 h, stimulés avec HGF (0, 01 ~ 1 nM), Fc (aMD4) B3 (1 ~ 100 nM), Fc (100 nM) ou non stimulés (Aucun) dans DMEM avec 10% de sérum pendant 10 min. Les cellules EHMES-1 ont été privées de sérum dans RPMI1640 avec 0, 2% de BSA pendant 3 h, stimulées avec HGF (0, 04 ~ 1, 1 nM), Fc (aMD4) B3 (1, 3 ~ 33 nM) ou non stimulées dans RPMI1640 avec 0, 2% de BSA pendant 10 min. Ces cellules ont été lavées avec du PBS glacé et lysées dans 400 µl de tampon de lyse (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, Triton X-100 1 %, NP-40 1 %, glycérol 10 %, fluorure de phénylméthylsulfonyle 1 mM, Na3VO4 1 mM, NaF 1 mM, acide éthylènediaminetétraacétique 1 mM et inhibiteurs de protéase). Les lysats ont été passés à travers une aiguille 27G et un filtre de 0,45 µm, et centrifugés. Les concentrations en protéines des lysats ont été mesurées par dosage de l'acide bicinchoninique (Thermo Fisher). Les surnageants ont été soumis à un Western Blot pour détecter Erk1/2 phosphorylé (T202/Y204) (dilution 1:1 000, D13.14.4E, Cell Signaling Technology), Erk1/2 (dilution 1:1 000, 137F5, Cell Signaling Technology), Akt phosphorylé (S473) (dilution 1:1 000, D9E, Cell Signaling Technology), Akt (1:1 000 0 dilution, 11E7, technologie de signalisation cellulaire) ou GAPDH (dilution 1:1 000, 14C10, technologie de signalisation cellulaire). Les surnageants ont été soumis à une immunoprécipitation avec un anticorps anti-Met (5 µg pour 600 µl de lysats, D-4, Santa Cruz Biotechnology) et western blot pour Met (dilution 1:1000, D1C2, Cell Signaling Technology), Met phosphorylée (Y1234/Y1235) (dilution 1:1000, D26, Cell Signaling Technology), Met phosphorylée (Y1003) (1:1, 000, 13D11, Cell Signaling Technology) ou Met phosphorylé (Y1349) (dilution 1:1 000, 130H2, Cell Signaling Technology). Les transferts ont été suivis par l'anticorps secondaire conjugué à la HRP (Dako) et la mesure de la chimioluminescence développée avec le réactif ImmunoStar LD (Wako), à l'aide du lecteur d'images FUSION-SOLO.6S.EDGE (VIRVER). Pour le tableau phospho-RTK, les hépatocytes ont été privés de sérum dans du DMEM avec 0,2 % de BSA pendant 3 h, stimulés avec HGF (1 nM), Fc(aMD4)B3 (100 nM), Fc (100 nM) dilué dans du DMEM avec 10 % de sérum pendant 10 min, lavés avec du PBS glacé, lysés dans 400 µl de tampon de lyse 17 (R&D Systems) avec de la protéase. cocktail d'inhibiteur (Nacalai Tesque), passé sur un filtre de 0,45 µm et centrifugé. Les lysats (1 mg) ont été analysés à l'aide du kit Human Phospho-RTK Array (R&D Systems).

L'ARN total de sphéroïdes d'hépatocytes ou de foies traités à l'ARNlater (Thermo Fisher) de souris PXB a été préparé à l'aide du réactif de lyse QIAzol (Qiagen) et expédié au laboratoire de bioingénierie (Kanagawa, Japon) pour le contrôle de la qualité de l'ARN et l'ARN-seq sur un séquenceur DNBSEQ-G400 (MGI Tech). Des bibliothèques d'ADN complémentaires pour RNA-seq ont été préparées à l'aide du kit de préparation de bibliothèques directionnelles MGIEasy RNA (MGI Tech) et évaluées à l'aide de l'analyseur de fragments AATI (Advanced Analytical Technologies). Les bibliothèques d'ADNc ont été circularisées à l'aide du kit de circularisation MGIEasy (MGI Tech), préparées sous forme de nano-billes d'ADN par le kit de séquençage à haut débit DNBSEQ-G400RS (MGI Tech), et suivies d'un séquençage massivement parallèle (2 × 100 bp) sur un séquenceur DNBSEQ-G400 (MGI Tech). Après avoir exclu les séquences adaptatrices à l'aide de cutadapt (ver. 1.9.1) et les séquences avec un score de faible qualité (<20) ou moins de 40 nucléotides à l'aide de faucille (ver 1.33), les lectures ont été alignées sur le génome humain de référence (GRCh38.p13) à l'aide du logiciel hisat2 (v2.2.0). Les données d'alignement ont été comptées à l'aide de featureCounts (ver. 2.0.0). Les abondances de transcription ont été mesurées en lectures par kilobase d'exon par million de lectures cartographiées (RPKM) et en transcriptions par million (TPM). L'analyse DEG a été réalisée à l'aide de DEGES dans TCC (v1.18.0) et DESeq (v1.30.0) (FDR < 0, 05 ou < 0, 01, Benjamini – Hochberg, bilatéral). Tous les DEG identifiés ont été soumis à une analyse par grappes à l'aide de Gene Cluster 3.0. Des termes GO considérablement enrichis ont été identifiés à l'aide de l'analyse d'enrichissement GO par PANTHER.

La demi-vie dans le sérum jusqu'à 9 h a été déterminée chez des souris C57BL/6 de type sauvage (femelles, 9 semaines, 18-21 g, obtenues auprès de Japan SLC) ayant reçu une seule injection dans la veine caudale à 0,7 mg kg-1 pour Fc, 0,74 mg kg-1 pour Fc(aMD4)B3 et 1,0 mg kg-1 pour HGF recombinant humain (Kringle Pharma), dilué dans 100 µl de PBS. La demi-vie dans le sérum jusqu'à 12 jours a été déterminée chez des souris hétérozygotes mFcRn−/− hFcRn Tg 276 (femelles, 9–12 semaines, 18–24 g) produites en interne par accouplement de souris mFcRn−/− et de souris homozygotes hFcRn Tg 276 obtenues auprès du Jackson Laboratory. Les souris ont reçu une seule injection dans la veine caudale à 0,7 mg kg-1 pour Fc ou 0,74 mg kg-1 pour Fc(aMD4)B3 dilué dans 100 µl de PBS. La demi-vie dans le sérum jusqu'à 12 jours a également été déterminée chez des souris chimériques avec un foie humanisé (souris PXB, PhoenixBio, mâle, > 12 semaines, 19–24 g) ayant reçu une seule injection dans la veine caudale ou une injection sous-cutanée à 5,0 mg kg-1 pour Fc(aMD4)B3, dilué dans 100 µl de PBS. Le sang a été prélevé de la veine sous-maxillaire à l'aide d'une lancette animale Goldenrod (Bio Research Center) ou du plexus orbital à chaque instant, transformé en sérum et stocké à -80 ° C jusqu'à l'analyse. Les concentrations sériques de Fc et de Fc(aMD4)B3 ont été déterminées à l'aide d'un immunoessai de reconnaissance d'immunoglobuline humaine (kit de quantification ELISA d'IgG humaines, Bethyl Laboratories). Les concentrations sériques de HGF ont été déterminées à l'aide d'un ELISA développé en interne. Toutes les procédures d'expérimentation animale ont été menées conformément aux directives fournies par la conduite appropriée des expériences animales (1er juin 2006, Conseil scientifique du Japon). Les procédures ont été approuvées par le Comité d'examen institutionnel de l'Université de Kanazawa ou le Comité d'éthique des animaux de laboratoire de PhoenixBio.

Des souris chimériques avec des foies humanisés (souris PXB, PhoenixBio) ont été générées à partir de souris ADNc-activateur du plasminogène de type urokinase/immunodéficience combinée sévère transplantées avec des hépatocytes humains, environ 80 % des hépatocytes étant humanisés48. Des souris PXB (mâles,> 12 semaines, 15 à 21 g) ont reçu une seule injection sous-cutanée à 5 mg kg -1 pour Fc (aMD4) B3 dans 200 µl de PBS ou de PBS témoin. Quarante-quatre heures après l'administration de Fc(aMD4)B3 ou de PBS témoin, de la 5-bromo-2'-désoxyuridine (BrdU) (Sigma Chemical) a été injectée par voie intrapéritonéale à des souris chimériques à une dose de 100 mg kg-1 pendant 2 h avant de tuer. Les foies isolés de souris PXB ont été traités avec RNAlater pour RNA-seq ou préparés pour la coloration BrdU. Des coupes de paraffine fixées au formol de foies chimériques ont été incubées avec un anticorps anti-BrdU de rat à 3 µg ml-1 (Abcam, ab6326), suivi d'un anticorps polyclonal de chèvre anti-rat IgG conjugué Alexa Fluor 488 à 1 µg ml-1 (Abcam, ab150157). Les noyaux ont été contre-colorés avec du 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, Thermo Fisher) à 300 nM. Les images fluorescentes ont été obtenues à l'aide de Keyence BZ-X810. Le nombre de noyaux BrdU positifs a été déterminé en comptant au moins 15 000 cellules dans 20 champs visuels sélectionnés au hasard dans des coupes du lobe latéral gauche et du lobe droit médial par animal. Les procédures impliquant des tissus hépatiques humanisés ont été approuvées par le comité d'éthique de l'utilisation des tissus humains de PhoenixBio. Toutes les procédures d'expérimentation animale ont été menées conformément aux directives fournies par la conduite appropriée des expériences animales (1er juin 2006, Conseil scientifique du Japon). Les procédures ont été approuvées par le comité d'éthique des animaux de laboratoire de PhoenixBio.

Les plaques MaxiSorp (Nunc) ont été recouvertes de TfR de souris recombinant (2 µg ml-1 dans du PBS, 50 µl par puits, R&D Systems) à 4 °C pendant une nuit, lavées avec 0,05 % de Tween 20 dans du PBS et bloquées avec 1 % de BSA dans du PBS. Les plaques ont été incubées avec des titrages en série 1:3 de dTfR(aMD4), sTfR(aMD4) ou Fc(aMD4) dilués avec 0,05 % de Tween 20 et 1 % de BSA dans du PBS à température ambiante pendant 1 h, lavés avec 0,05 % de Tween 20 dans du PBS, incubés avec un anticorps anti-IgG Fc humain conjugué à la HRP (0,5 µg ml-1, 1 00 µl par puits, Bethyl Laboratories) à température ambiante pendant 1 h et lavé avec 0,05 % de Tween 20 dans du PBS. Les signaux ont été générés par incubation avec un substrat de 3,3′,5,5′-tétraméthylbenzidine (Cell Signaling Technology) et l'absorbance a été lue à l'aide d'un lecteur de plaques ARVO MX (Perkin Elmer).

Des souris C57BL/6 de type sauvage (femelles, 7–8 semaines, 17–20 g, obtenues auprès de SLC) ont reçu une seule injection dans la veine caudale à une quantité équimolaire par kg : 26,5 mg kg−1 pour dTfR(aMD4), 20,0 mg kg−1 pour sTfR(aMD4) ou 12,0 mg kg−1 pour Fc(aMD4), dilués dans 200 µl de PBS. Vingt-quatre heures après l'injection, les souris ont été anesthésiées et du sang a été prélevé du ventricule droit et transformé en sérum. Les cerveaux ont été isolés des souris après perfusion avec du PBS à un débit de 2 ml min-1 pendant 8 min. Chaque moitié du cerveau a été homogénéisée dans du NP-40 à 1% (Calbiochem) dans du PBS contenant des comprimés de cocktail d'inhibiteurs de protéase sans EDTA CompleteMini (Roche Diagnostics), mis en rotation à 4 ° C pendant 1 h, centrifugé à 14 000 tr / min pendant 20 min et surnageants collectés. Le sérum et les lysats cérébraux ont été soumis à une mesure d'anticorps à l'aide d'un immunodosage de reconnaissance d'immunoglobuline humaine (kit de quantification ELISA d'IgG humaines, Bethyl Laboratories). Pour calculer les concentrations dans le cerveau, ng g−1 cerveau a été considéré comme ng ml−1. Chaque moitié du cerveau a été incluse dans un composé à température de coupe optimale (Sakura Finetek Japon), congelée dans de l'azote liquide et sectionnée à 10 µm d'épaisseur. Après fixation dans du paraformaldéhyde 4% en PBS pendant 30 min, les coupes ont été bloquées en BSA 5%, Triton X-100 0,3% en PBS et colorées avec un anticorps IgG Fc de chèvre anti-humain (dilution 1:500, Bethyl Laboratories) et un anticorps NeuN de souris anti-souris (dilution 1:500, Millipore), un anticorps anti-GFAP de souris (dilution 1:500, GA5, Cell Signaling Technologies) ou un anticorps anti-Iba1 de souris (dilution 1:500, GT10312, GeneTex) dans 1 % de BSA et 0,1 % de Triton X-100 dans du PBS à 4 °C pendant la nuit. Anti-humain IgG Fc et anti-NeuN ont été visualisés avec un anticorps secondaire anti-chèvre conjugué Alexa Fluor 488 ou un anticorps secondaire anti-souris conjugué Alexa Fluor 594, respectivement (dilution 1: 200, Thermo Fisher). Des images fluorescentes des régions corticales ont été obtenues avec le Keyence BZ-X810. Cette étude a été approuvée par le Comité d'examen institutionnel de l'Université de Kanazawa et réalisée conformément aux directives et réglementations.

Graphpad Prism 6.0d a été utilisé pour la représentation graphique et l'analyse statistique. Les méthodes statistiques pertinentes pour les expériences individuelles sont détaillées dans les légendes des figures.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les principales données à l'appui des conclusions de cette étude sont disponibles dans l'article et ses informations supplémentaires. Les données RNA-seq sont disponibles sur DDBJ Sequence Read Archive sous les numéros d'accession DRA014557 (sphéroïdes d'hépatocytes) et DRA014558 (foies de souris PXB). Les données brutes générées au cours de l'étude sont disponibles auprès des auteurs correspondants sur demande raisonnable. Les données sources des figures sont fournies avec ce document.

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Ce travail a été soutenu par : World Premier International Research Center Initiative (WPI), MEXT, Japon ; une subvention pour la recherche scientifique JSPS (C) (20K06553) à KS ; une subvention pour la recherche scientifique JSPS (B) (19H03499) et la recherche stimulante (21K18250) à KM ; Programme de recherche fondamentale et clinique sur l'hépatite de l'Agence japonaise pour la recherche et le développement médicaux (AMED) (JP21fk0210087) à KS ; Projet de plateforme AMED pour le soutien à la découverte de médicaments et à la recherche en sciences de la vie (base pour le soutien à la découverte de médicaments innovants et à la recherche en sciences de la vie) à HS (JP19am0101090) et JT (JP19am0101075) ; et une subvention pour la recherche scientifique JSPS (B) (21H01771) à MS Ce travail a été réalisé dans le cadre du programme de recherche coopérative de l'Institut de recherche sur les protéines de l'Université d'Osaka (CR15-05) et d'une subvention de recherche collaborative extra-muros de l'Institut de recherche sur le cancer (Université de Kanazawa). Nous remercions Dolphin Co. Ltd pour la révision en anglais.

Division de la dynamique et de la régulation des tumeurs, Institut de recherche sur le cancer, Université de Kanazawa, Kanazawa, Japon

Katsuya Sakai, Nichole Marcela Rojas-Chaverra, Hiroki Sato, Ryu Imamura, Itsuki Sakai et Kunio Matsumoto

WPI-Nano Life Science Institute (WPI-NanoLSI), Université de Kanazawa, Kanazawa, Japon

Katsuya Sakai, Ryu Imamura, Mikihiro Shibata et Kunio Matsumoto

Laboratoire de synthèse et d'expression des protéines, Institut de recherche sur les protéines, Université d'Osaka, Suita, Japon

Nozomi Sugano-Nakamura, Emiko Mihara, Sayako Watanabe et Junichi Takagi

Unité de recherche sur le microenvironnement tumoral, Institute for Frontier Science Initiative, Université de Kanazawa, Kanazawa, Japon

Hiroki Sato et Kunio Matsumoto

Unité d'inflammation et de plasticité épithéliale, Institut de recherche sur le cancer, Université de Kanazawa, Kanazawa, Japon

Dominic Chih-Cheng Voon

Cancer Model Research Innovative Unit, Institute for Frontier Science Initiative, Université de Kanazawa, Kanazawa, Japon

Dominic Chih-Cheng Voon

Département de recherche et développement, PhoenixBio Co. Ltd, Higashihiroshima, Japon

Chihiro Yamasaki et Chise Tateno

AFM à grande vitesse pour l'unité d'application biologique, Institute for Frontier Science Initiative, Université de Kanazawa, Kanazawa, Japon

Mikihiro Shibata

Département de chimie, Graduate School of Science, Université de Tokyo, Tokyo, Japon

Hiroaki Suga

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KS, H. Suga, JT et KM ont conçu et conçu l'étude. KS a effectué l'expression et la purification de protéines, des tests cellulaires, SPR pour FcRn, réticulation, ARN-seq, expériences de demi-vie sérique et test de liaison mTfR. NS-N. effectué une cytométrie en flux et une SPR pour Met. EM a effectué une évaluation préliminaire des greffons Fc et de leurs activités. SW a effectué l'expression et la purification des protéines, ainsi que la cartographie du site de liaison via les expériences Met chimériques. RMN-C. effectué des expériences de pénétration BBB. IS effectué ds-variantes. H. Sato a fait de l'immunohistochimie et a contribué à des expérimentations animales. RI a contribué à des expérimentations animales. Le DC-CV a contribué aux expérimentations animales et a révisé de manière critique le manuscrit. CY et CT ont effectué un marquage BrdU chez des souris PXB. MS a effectué HS-AFM. Le manuscrit a été rédigé par KS Tous les auteurs ont discuté des résultats et commenté le manuscrit.

Correspondance à Katsuya Sakai, Junichi Takagi ou Kunio Matsumoto.

H. Suga et JT sont co-fondateurs et actionnaires de MiraBiologics Inc. EM, KS et KM sont également actionnaires de la même société. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Biomedical Engineering remercie Richard Siegel, Birgit Schoeberl, Manuel Sanchez-Felix et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Le milieu conditionné de la culture en suspension Expi293F exprimant le contrôle Fc ou les variants Fc a été extrait à l'aide de billes de protéine A et analysé par SDS-PAGE dans des conditions non réductrices et coloré avec du bleu brillant de Coomassie. L'image pour Fc(aMD4) a été reproduite à partir de notre rapport précédent27.

Sensorgrammes de liaison de Fc ou Fc(aMD4) au MetECD humain tel que déterminé par résonance plasmonique de surface. Les courbes mesurées sont indiquées en rouge. Les courbes ajustées sont représentées en noir. RU, unités de résonance ; SPR, résonance plasmonique de surface.

a, Niveaux de phosphorylation des résidus de tyrosine Met dans les cellules EHMES-1 traitées avec HGF ou Fc(aMD4)B3 pendant 10 min. Les lysats ont été analysés par Western blot. bc, les cellules EHMES-1 ont été traitées avec HGF (b) ou Fc(aMD4)B3 (c). L'activation de Met, Akt ou Erk1/2 à chaque instant après la stimulation a été quantifiée in situ avec un anticorps anti-phosphorylé Met (Tyr1234/1235), anti-phosphorylé Akt (S473) ou anti-phosphorylé Erk1/2 (T202/Y204), respectivement. Les résultats sont présentés sous la forme de la moyenne ± SEM de l'induction par rapport aux témoins non stimulés (n = 4, expériences indépendantes).

Données source

a, L'association entre le Fc (aMD4) B3 et le MetECD humain, le MetECD de souris ou le MetECD chimérique qui a fusionné de manière variable l'homme et la souris a été évaluée par un test pull-down. Le MetECD marqué par PA a été précipité à l'aide de billes conjuguées d'anticorps anti-PA tag. Conformément à notre précédent rapport selon lequel le peptide aMD4 se lie au MetECD40 humain mais pas à la souris, Fc(aMD4)B3 lié au MetECD humain (hWT) mais pas au MetECD de souris (mWT). Le remplacement du domaine PSI et des domaines IPT par la séquence de souris (variantes A – E) a préservé la liaison au Fc(aMD4)B3, indiquant que le domaine PSI et les domaines IPT étaient indispensables pour la liaison du Fc(aMD4)B3. En revanche, des résidus spécifiques à l'homme dans les lames 5 à 7 du domaine Sema étaient nécessaires pour la liaison Fc (aMD4) B3 (variante F). Les nombres dans le domaine Sema indiquent chaque lame. b, les résidus spécifiques à l'homme dans la lame 6 (B6-1 et B6-2 en d) étaient indispensables pour la liaison du Fc(aMD4)B3. c, les résidus spécifiques à l'homme dans la lame 5 (B5-1 et B5-2 en d) étaient également indispensables ou contribuaient à la liaison du Fc(aMD4)B3, respectivement. d, alignement des séquences d'acides aminés des domaines Met Sema humains et murins. Les résidus qui sont différents entre l'homme et la souris sont indiqués en gras. Les barres rouges (B5-1, B6-1 et B6-2) indiquent les résidus indispensables à la liaison Fc(aMD4)B3. La barre orange (B5-2) indique les résidus qui contribuent à la liaison du Fc(aMD4)B3.

a, le poids moléculaire analysé par SDS-PAGE a indiqué un complexe 2: 1 et 1: 1 de MetECD et Fc (aMD4) B3. L'analyse SDS-PAGE a été réalisée en utilisant des gels à 7, 5% (bleu, de la Fig. 3b) et des gels à 3-10% (orange, de b). b, analyse SDS-PAGE de la formation de dimères Met par Fc(aMD4) in vitro. Les complexes entre MetECD et Fc(aMD4) ou le Fc témoin ont été réticulés par BS3 et analysés par SDS-PAGE (gel 3-10 %) dans des conditions non réductrices et colorés à l'argent. c, MetECD et Fc(aMD4)B3 ont été réticulés par BS3 et soumis à une chromatographie d'exclusion de taille (SEC). Les résultats de la SDS-PAGE non réductrice des fractions SEC avec coloration au bleu brillant de Coomassie sont présentés. La fraction indiquée en rouge a été soumise à HS-AFM comme le montre la Fig. 3e, f.

Données source

a, Capteurgrammes de liaison de Fc à FcRn/β2 M à pH 6,0 et 7,4. Ass, ajout de Fc ; Diss, tampon de lavage. b, Capteurgrammes de liaison de Fc ou Fc(aMD4) à FcRn/β2 M à pH 6,0. Les sensorgrammes montrent des doublons de trois concentrations d'analytes (250, 500, 1 000 nM). RU, unités de résonance ; SPR, résonance plasmonique de surface.

Chiffres supplémentaires.

Analyse HS-AFM de Fc(aMD4)B3.

Analyse HS-AFM de MetECD.

Analyse HS-AFM d'un complexe 2: 1 de MetECD et Fc (aMD4) B3 avec les domaines de tige IPT pulvérisés.

Analyse HS-AFM d'un complexe 2: 1 de MetECD et Fc (aMD4) B3 avec les domaines de tige IPT attachés.

Données sources pour la Fig. 3 supplémentaire.

Données sources pour la Fig. 6 supplémentaire.

Données source.

Données source.

Données source.

Données source.

Données source.

Données source.

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Réimpressions et autorisations

Sakai, K., Sugano-Nakamura, N., Mihara, E. et al. Concevoir des agonistes des récepteurs avec une pharmacocinétique améliorée en greffant des peptides macrocycliques dans des régions cristallisables de fragments. Nat. Biomédical. Eng 7, 164–176 (2023). https://doi.org/10.1038/s41551-022-00955-6

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Reçu : 22 octobre 2021

Accepté : 26 septembre 2022

Publié: 07 novembre 2022

Date d'émission : Février 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41551-022-00955-6

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