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Jan 07, 2024

Structure CryoEM et mécanisme d'assemblage d'un gardien du génome d'un virus bactérien

Volume Communication Nature

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 7283 (2022) Citer cet article

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De nombreux virus emballent leur génome dsDNA dans des capsides préformées via un portier de portail qui est ensuite fermé. Nous rapportons la structure du complexe de gardien d'ADN du bactériophage SPP1 (gp612gp1512gp166) dans l'état post-empaquetage de l'ADN à une résolution de 2,7 Å obtenue par microscopie cryo-électronique à une seule particule. La comparaison du complexe SPP1 natif avec des structures naïves à l'assemblage de composants individuels a révélé le programme complexe de changements conformationnels conduisant à son assemblage. Après l'encapsidation de l'ADN, gp15 se lie via son extrémité C-terminale à l'oligomère gp6 positionnant les sous-unités gp15 pour l'oligomérisation. Gp15 replie ses boucles internes créant un barillet β inter-sous-unités qui établit différents types de contacts avec six sous-unités gp16. La liaison et l'oligomérisation de Gp16 s'accompagnent d'un repliement des hélices qui ferment le canal porte pour maintenir le génome viral à l'intérieur de la capside. Ce mécanisme d'assemblage a de larges implications fonctionnelles et évolutives pour les virus de la lignée des virus à queue procaryote-virus de l'herpès.

De nombreux virus à ADN double brin (dsDNA) ont un complexe portail spécialisé à un sommet 5 fois de leur capside icosaédrique à travers lequel le dsDNA entre et sort du virion. Les virus procaryotes à queue et les virus de l'herpès forment un précurseur de capside virale, appelé procapside, avant l'encapsidation de l'ADN. La procapside contient un complexe protéique portail intégré1,2,3,4,5 qui sert de plate-forme d'amarrage pour la terminase. Le complexe du portail et de la terminase constitue le moteur d'encapsidation du génome viral qui transloque l'ADNdb dans la procapside. L'ADN serré (>400 mg/mL) exerce une pression sur la capside qui peut atteindre ~60 atm6,7. La dissociation de la terminase du moteur est suivie par la fermeture du vertex porte pour empêcher la fuite du génome viral concentré3. L'étanchéité du canal portail est obtenue en liant les protéines de complétion de la tête pour assembler un connecteur complexe nommé dans les virus procaryotes à queue, qui consiste en des oligomères cycliques empilés créant un canal pour le trafic d'ADN3,8,9,10. L'ouverture du connecteur fermé est nécessaire pour l'entrée de l'ADN dans le tube de queue et sa livraison ultérieure à la cellule hôte au début de l'infection.

Des structures CryoEM et X-ray ont été rapportées pour un certain nombre de protéines portales5,8,11,12,13,14, pour le complexe du portail P22 avec la protéine adaptatrice15 et pour certaines protéines isolées qui participent à ce processus3,16,17,18,19. Les études CryoEM ont fourni plus d'informations structurelles sur le complexe portail assemblé après l'empaquetage de l'ADN10 et lorsque la queue est attachée au sommet portail8,20,21,22,23. Néanmoins, le mécanisme moléculaire derrière l'assemblage de l'ADN gardien à l'état d'empaquetage du génome post-viral est encore inconnu.

Dans le bactériophage SPP1, les protéines de complétion de tête gp15 et gp16 se lient séquentiellement à la protéine portaile dodécamérique gp6 après l'encapsidation de l'ADN9,10,19. La protéine adaptatrice gp15 étend le tunnel porte qui est ensuite fixé en liant la protéine stoppeur gp16. Nous rapportons ici une structure cryoEM du connecteur SPP1 du bactériophage de 902 kDa dans l'état d'emballage post-ADN à une résolution de 2,7 Å. Le connecteur a été extrait de capsides remplies d'ADN sans queue pour éviter que des sous-unités de protéines de capside ne l'entourent à des positions incompatibles. Cette stratégie nous a permis de concentrer le traitement d'image sur l'analyse du complexe connecteur et d'obtenir une structure à haute résolution. Le traçage de novo de ses 30 chaînes polypeptidiques au sein de la carte cryoEM nous a permis de déterminer un modèle atomique de l'ensemble du complexe connecteur (gp612gp1512gp166). La comparaison structurelle des composants de la protéine connecteur avec leurs états naïfs d'assemblage en solution déduit un chemin séquentiel de changements conformationnels et différents types d'interactions engagées lors de l'assemblage du gardien d'ADN viral. Cette étude structurelle révèle également comment la transition de symétrie se produit dans le connecteur pour correspondre à la symétrie de la queue.

Le complexe connecteur SPP1 de 902 kDa a été purifié à partir de capsides remplies d'ADN sans queue rompues9. La structure du connecteur a été déterminée par analyse de particules uniques cryoEM à une résolution de 2, 7 Å (au seuil de 0, 5 du FSC) (Fig. 1, voir Méthodes et tableau supplémentaire 1). Cette résolution a permis un traçage de novo sans ambiguïté des chaînes polypeptidiques de gp6, gp15 et gp16 dans la carte cryoEM du complexe (Figs. 1 et 2 supplémentaires). Nous avons constaté que le connecteur comprend 12 sous-unités de gp6 et de gp15, mais seulement 6 copies de gp16 (Fig. 1) contrairement aux rapports précédents10,19,20. Gp15 et gp16 sont monomères avant de s'assembler dans le connecteur24. Après l'encapsidation de l'ADN, gp15 se lie au portail formant un oligomère cyclique dodécamère. Cette étape d'assemblage se produit indépendamment de gp1620. La fermeture du complexe connecteur nécessite la liaison de gp16 à gp15, conduisant à l'assemblage du 6-mer gp16 (Fig. 1) qui retient l'ADN du phage à l'intérieur de la capside virale10,20. Ces observations combinées à la structure de connecteur obtenue (Fig. 1) révèlent que l'assemblage du connecteur implique des événements d'interaction gp6-gp15, gp15-gp15, gp15-gp16 et gp16-gp16.

une carte CryoEM du connecteur SPP1. Une sous-unité de chaque oligomère gp6, gp15 et gp16 est représentée respectivement en bleu, magenta et vert. b Modèle atomique du connecteur. Pour plus de clarté, seule la moitié avant de l'oligomère est représentée. Quatre sous-unités de gp6 sont affichées en violet, cyan, bleu et bleu foncé. Quatre sous-unités de gp15 sont en orange, rouge, magenta et marron. Trois copies de gp16 sont dans des déclinaisons de vert. Les numéros de sous-unités avec leurs codes de couleur indiqués à droite sont utilisés de manière cohérente tout au long du manuscrit. c Dodécamère Gp15 vu du côté de la capside (panneau de gauche). Les éléments structurels secondaires sont étiquetés sur une sous-unité (panneau de droite). d Hexamère Gp16 vu du côté de la capside (panneau de gauche). Les éléments structurels secondaires sont étiquetés sur une sous-unité (panneau de droite).

La chaîne polypeptidique de gp6 a été tracée dans la carte de densité cryoEM du résidu 28 à 470 sur 503 résidus (Fig. 2a). Le pli global de gp6 dans le connecteur est similaire au pli de gp6 dans la forme naïve à l'assemblage 13-mer (PDB 2JES)12. Gp6 englobe quatre domaines principaux : la couronne, l'aile, la tige et le clip (Fig. 2a, b). Il comporte également une boucle de tunnel qui fait saillie vers l'intérieur du tunnel central du portail et une épingle à cheveux β à la surface externe du domaine de la tige (Fig. 2a, b).

a Éléments structurels secondaires de la sous-unité gp6 dans le connecteur SPP1. Les domaines sont codés par couleur : le domaine de la couronne (résidus 421-470) est en vert, le domaine des ailes (résidus 28-54, 88-255 et 369-420) en orange, la boucle tunnel avec la région inclinée de l'hélice α6 (résidus 347-368) en rouge, le domaine de la tige (résidus 55-62, 81-87, 256-280 et 327–346) en magenta, l'épingle à cheveux gp6 β (résidus 63–80) en bleu et le domaine clip (résidus 281–326) en cyan. b Superposition de la sous-unité gp6 du connecteur (12-mer) et de la sous-unité du 13-mer naïf d'assemblage gp6 (en gris ; PDB 2JES). c Domaine de clip du gp6 13-mer. d Clip domaine de gp6 dans le complexe connecteur. Les résidus 307–312 de gp6, chaîne i-1, sont représentés en violet, 281–326 de la chaîne i en cyan, les résidus 291–294 de la chaîne i + 1 en bleu et les résidus 64–76 de la chaîne i + 2 en bleu foncé. Le clip est dans la même orientation qu'en b. La distance de 7 Å indique le décalage de α4 dans le connecteur par rapport à α4 dans le gp6 13-mer (voir c). e Localisation des mutations altérant l'emballage de l'ADN SPP1 avec des résidus colorés en fonction de leur groupe de mutation (voir tableau supplémentaire 2). Le sous-ensemble connecteur gp6 est tourné de 180° par rapport à a et b.

Le gp6 12-mer dans le connecteur et le gp6 13-mer12 naïf d'assemblage sont très similaires dans la partie interne du domaine de l'aile (résidus 29–54, 88–169, 178–208 et 369–420, avec RMSD entre les positions Cα de 0,7 Å) et dans la tige porte (résidus 55–62, 81–87, 256–280, 327–346, RMSD 0,5 Å) (Fig. 2b). Cependant, des différences structurelles notables ont été trouvées dans la zone de la couronne, les boucles de tunnel, les épingles à cheveux β et les domaines de clip (Fig. 2b). La boucle tunnel forme une courte hélice dans gp6 à l'intérieur du connecteur, alors que cette hélice est absente dans le gp6 13-mer12 (Fig. 2b). La faible densité de cryo-électrons de la boucle tunnel dans le connecteur gp6 suggère que ce segment est plutôt flexible. La différence la plus significative entre le connecteur gp6 et le gp6 13-mer se trouve dans le domaine de clip qui crée la liaison intersous-unité la plus étendue dans les deux oligomères portails (Fig. 2c, d). Le clip est formé par un feuillet β triple brin inter-sous-unité, composé des brins β12 et β14 de la sous-unité i et β13 de la sous-unité i-1, et de l'hélice α4 de la sous-unité i (Fig. 2c, d). Ces éléments structuraux se trouvent dans les deux structures gp6 (12-mer et 13-mer) mais présentent des décalages visibles entre les résidus Gln282 à la fin de l'hélice α3 et Pro325 au début de l'hélice α5 (Fig. 2b – d). Dans le gp6 13-mer, l'hélice α4 a une orientation inclinée12 avec son résidu N-terminal Pro296 localisé au bas du clip (Fig. 2c; Fig. Supplémentaire 3a). Dans le connecteur gp6, Pro296 est décalé vers le haut de 7 Å amenant l'hélice α4 à une orientation plus horizontale plus proche de l'épingle à cheveux β gp6 de la sous-unité i + 2 (Fig. 2d). Ces changements dans les domaines de clip du connecteur gp6 conduisent à la formation de poches où les extrémités C-terminales de gp15 se lient à l'oligomère portail (Fig. 3b, c supplémentaires). De telles poches sont absentes dans le gp6 13-mer naïf d'assemblage (Fig. 3a supplémentaire), ce qui explique pourquoi il ne se lie pas à gp1524.

La structure de gp6 dans l'état post-empaquetage de l'ADN permet de rationaliser l'effet des mutations précédemment démontrées comme altérant le processus d'empaquetage de l'ADN SPP125,26. Étant donné que ces protéines gp6 mutées sont incorporées dans les procapsides, cela implique qu'elles sont correctement repliées et interagissent avec les autres composants de la procapside assurant un assemblage correct de la procapside25. Les résidus critiques pour l'emballage de l'ADN25,26 sont situés dans différents éléments structurels de la structure porte (Fig. 2e).

Plusieurs mutations cartographiées dans l'aile portaile (Fig. 2e, en orange) provoquent apparemment une déstabilisation locale de ce domaine (Tableau supplémentaire 2). Il est difficile d'interpréter comment leur effet sur la structure perturbe l'emballage de l'ADN à travers le tunnel central portail.

Un ensemble de mutations qui bloquent l'emballage de l'ADN a été trouvé dans la couronne gp6. Cette région forme la partie supérieure du canal tunnel à travers lequel l'ADN est transloqué à l'intérieur de la capside. Les mutations affectant l'organisation structurale de la couronne impliquent des résidus engagés dans la liaison inter-sous-unités (Ser428, Ile437, Phe449) et/ou déstabilisent le noyau hydrophobe de la couronne (Ile437Val, Ala443Thr, Phe449Leu) formé par les hélices α7 et α8 (Fig. 2e, en vert ; Tableau complémentaire 2).

Un autre groupe de résidus mutés affecte soit la structure de la boucle tunnel gp6 (Ser350, Glu352), soit l'interaction de la boucle avec α5 (Val347, Lys373) et la couronne porte (Gly360). Ils mettent en évidence un rôle des boucles dans le processus d'emballage de l'ADN (Fig. 2e, en rouge ; Tableau supplémentaire 2). Nous avons précédemment montré que la substitution Glu352Gly conduit à une réduction de l'activité terminase ATPase27. Cette diaphonie entre les boucles tunnel et la terminase pendant la translocation de l'ADN est médiée, en théorie, par l'hélice α5 et la région du clip gp628.

L'emballage de l'ADN est également perturbé par la mutation de Pro325 (Fig. 2e, en violet) située à une position charnière entre l'hélice α5 et le clip. Les chaînes polypeptidiques du gp6 13-mer et du connecteur gp6 12-mer changent de conformation à ce stade, ce qui entraîne une position différente du clip dans les deux structures (Fig. 2b – e). La substitution Pro325Leu perturbe la liaison inter-sous-unités et peut allonger la longueur de l'hélice α5, affectant le positionnement correct des éléments de clip.

Le prochain ensemble important de mutations se trouve dans les boucles ancrant l'épingle à cheveux β gp6 à proximité de l'aile et de la tige (Fig. 2b, en bleu). Nous émettons l'hypothèse que les mutations de cette épingle à cheveux modifient sa position par rapport au domaine du clip (Fig. 2d, β1-β2 en bleu), empêchant la formation de la poche du clip. Le rôle essentiel de la poche à clip dans l'emballage de l'ADN est révélé par l'effet hautement néfaste des substitutions d'acides aminés dans Asn290, Gly293 et ​​Glu29425 de la boucle β12-α4 (Fig. 2e, en cyan; Tableau supplémentaire 2). Ces trois résidus sont exposés à l'extérieur du portail (Fig. 2e). Asn290 est situé à l'extrémité de la boucle β12-α4, avec sa chaîne latérale engagée dans des liaisons hydrogène intra-sous-unité et inter-sous-unité avec le carbonyle d'Asp314 et avec l'azote de Gly313, respectivement (Fig. 4 supplémentaire). Ces interactions imitent les interactions bêta et sont essentielles pour le positionnement correct des boucles β12-α4 et β13-β14 dans le domaine du clip. La substitution d'Asn290 perturbe une ou les deux liaisons hydrogène déstabilisant ces boucles. Gly293 et ​​Glu294 ne font aucun contact de chaîne latérale suggérant que le phénotype de leur substitution résulte d'un défaut dans l'interaction directe avec la terminase29. La perturbation de cette interaction lors du démontage du moteur d'emballage rend la poche de clip gp6 prête pour la liaison gp15. L'interaction séquentielle de la terminase et de gp15 avec la même région gp6 du clip est corroborée en constatant que la mutation Glu294Lys perturbe l'emballage de l'ADN SPP1 tandis que la substitution du même résidu Glu294Gly n'altère que l'étape d'assemblage ultérieure de la liaison à gp1526 (tableau supplémentaire 2 ; voir ci-dessous). Collectivement, cette analyse structure-fonction met en évidence les éléments structurels qui tapissent le canal portail et le clip en tant que facteurs essentiels pour l'emballage de l'ADN du phage.

La terminaison de l'encapsidation de l'ADN est suivie du départ de la terminase et de la fixation de gp15 à gp6, initiant l'assemblage du connecteur. Le noyau de gp15 comprend 4 hélices (Fig. 1c, panneau de droite). Son extrémité C-terminale est dirigée vers gp6 tandis que l'épingle à cheveux β1-β2 pointe vers gp16. Gp15 interagit avec l'oligomère gp6 principalement via l'insertion de son extrémité C-terminale dans la poche du clip gp6 (Fig. 3a, b; Fig. 3c supplémentaire). L'extrémité C-terminale gp15 de la chaîne j + 1 établit neuf liaisons interchaînes avec le clip de la chaîne gp6 i (tableau supplémentaire 3). Gp15 His37 de la chaîne j + 1 établit également une liaison avec le résidu de clip Asp292 de la chaîne gp6 i + 1 (Fig. 3b) tandis que gp15 Arg102 établit une liaison hydrogène avec le carbonyle de Asp68 à partir de l'épingle à cheveux β de la chaîne gp6 i + 2 (Fig. 3b; Tableau supplémentaire 3). Ce réseau d'interaction explique pourquoi la mutation Glu294Gly dans gp6, qui perturbe sa liaison hydrogène avec gp15 Met100 (Fig. 3b), ou le remplacement des cinq résidus C-terminaux (ArgLysMetAlaArg) dans gp15 par MetAlaGly, empêche la liaison stable de gp15 à gp620,26. Ces interactions sont caractérisées par une complémentarité de potentiel électrostatique entre l'extrémité C-terminale de gp15 et la poche de gp6 et leur correspondance de forme (Fig. 5a supplémentaire).

une interface gp6-gp15. L'extrémité C-terminale de la sous-unité gp15 j + 1 (en magenta) interagit avec la poche de clip formée par trois sous-unités gp6 représentées en cyan (i), bleu (i + 1) et bleu foncé (i + 2) comme sur la Fig. 1b. Vue de l'extérieur du connecteur. b Zoom en vue des interactions gp6-gp15 de la zone délimitée en a. Les liaisons hydrogène interchaînes et les ponts salins entre les sous-unités gp6 et gp15 sont affichés sous forme de lignes pointillées en noir. c Comparaison du monomère gp15 naïf d'assemblage (à gauche) (PDB 2KBZ) et de la sous-unité gp15 dans le connecteur (au centre) superposés à travers leur noyau α-hélicoïdal (magenta). L'hélice α0 est représentée en vert, la boucle α2-α3 est en bleu et l'extrémité C-terminale est en orange. La superposition de la sous-unité gp15 du connecteur avec le monomère RMN (en gris) est indiquée dans le panneau de droite. La flèche verte indique la rotation de l'hélice α0 sur ~145°. Les extrémités N et C du monomère RMN gp15 (Nm et Cm) et de la sous-unité gp15 dans le connecteur (Nc et Cc) sont étiquetées dans la superposition. d Interaction intersous-unité de gp15 α0 avec l'hélice α1 de la sous-unité adjacente vue de l'extérieur du connecteur. e Liaison inter-sous-unités Gp15 Glu85 vue depuis le tunnel du connecteur. f La vue depuis la surface extérieure du canon β montre les contacts d'interface entre le rebord inférieur du canon β gp15 et gp16. Les lignes pointillées indiquent des liaisons hydrogène et des ponts salins entre une sous-unité gp16 et trois sous-unités gp15. g Vue latérale du barillet β montrant l'interaction entre gp15 et l'extrémité N-terminale de gp16.

La gp15 naïve d'assemblage (PDB 2KBZ) est un monomère en solution composé d'un noyau α-hélicoïdal, d'une boucle flexible α1-α2, d'une grande boucle non structurée entre les hélices α2 et α3 et de l'extrémité C flexible, comme le montrent les structures RMN19. Le noyau α-hélicoïdal α1-α3 conserve sa conformation après l'assemblage de gp15 dans le connecteur, mais α0, la boucle α2-α3 et l'extrémité C-terminale subissent des changements conformationnels majeurs (Fig. 3c, en vert, bleu et orange, respectivement). L'extrémité C-terminale de gp15 interagit avec gp6 (Fig. 3a, b; Fig. 3c supplémentaire). L'extrémité N-terminale et α0 subissent une rotation de 145 ° pour établir des contacts avec les hélices α1 et α2 (flèche verte sur la Fig. 3c, panneau de droite). L'hélice α0 de la sous-unité j établit également des liens avec la sous-unité adjacente via les résidus Arg5 et Arg8 formant des ponts salins avec Glu23 de α1 de la sous-unité j-1 (Fig. 3d). Le changement conformationnel le plus spectaculaire a lieu en repliant la boucle α2-α3 dans l'épingle à cheveux β1-β2 qui forme le barillet β intermoléculaire à 24 brins gp15 (Figs. 1b, c et 3c).

La surface d'interaction entre une seule sous-unité gp15 et gp6 dans le connecteur n'est que d'environ 700 Ų et l'énergie de dissociation calculée est de -1, 6 kcal / mol, telle qu'évaluée par EBI-PISA30 (tableau supplémentaire 4). Cela indique que le seul monomère gp15 ne se lie pas fortement au cycle gp631. En revanche, les sous-unités gp15 adjacentes ont une surface d'interaction d'environ 1250 Ų et une énergie de dissociation de -13,3 kcal/mol (tableau supplémentaire 4). En outre, chaque sous-unité gp15 établit des interfaces avec deux sous-unités gp15 adjacentes lorsque ses formes 12mer cycliques lors de l'assemblage du connecteur. L'attachement initial des monomères gp15 à gp6 est ainsi suivi d'interactions inter-sous-unités gp15 qui assurent une association stable de gp15 à l'oligomère gp6.

L'interface gp15-gp15 comprend des contacts latéraux entre l'hélice α1 de la sous-unité j-1 et les hélices α0 et α2 de la sous-unité adjacente j (tableau complémentaire 3). De plus, l'hélice α0 lie l'hélice α1 des sous-unités adjacentes à la périphérie du connecteur via un réseau de ponts salins et de liaisons hydrogène (Fig. 3d). Les épingles à cheveux gp15 β1-β2 des sous-unités voisines forment un barillet β intersous-unité à 24 brins distal du portail (Fig. 1b, c) qui décrit le tunnel central de 34 Å de large de gp15 (Fig. 1c). Au sein de chaque sous-unité gp15, l'épingle à cheveux β est connectée à son noyau hélicoïdal α via les boucles α2-β1 et β2-α3 (Fig. 3c, e). Le groupe carboxylate de Glu85 dans la boucle β2-α3 de la sous-unité j établit cinq liaisons hydrogène avec la chaîne principale et les chaînes latérales de Ser88 et Thr89 de la sous-unité j + 1 (Fig. 3e), stabilisant le positionnement global des brins β-tonneau.

La partie inférieure du connecteur est formée de six sous-unités gp16. Chacun d'eux comprend un noyau de tonneau β, l'hélice α tunnel α1 et la boucle β1-β2 qui dépasse sous le connecteur et interagit vraisemblablement avec la queue (Fig. 1d).

L'interface entre le dodécamère gp15 et l'hexamère gp16 est également caractérisée par une complémentarité électrostatique (Fig. 5b supplémentaire). La plupart des interactions gp15-gp16 impliquent le bord inférieur du barillet β à 24 brins gp15 (Figs. 1b et 3f, g). Chaque sous-unité gp16 établit des contacts avec quatre sous-unités gp15 (Fig. 3f; Tableau supplémentaire 3). Remarquablement, les résidus Thr77 de trois sous-unités gp15 différentes interagissent avec la même sous-unité gp16 k (Fig. 3f). Thr77 de la chaîne gp15 j + 1 établit une liaison hydrogène avec gp16 Ser91 tandis que Thr77 de la chaîne gp15 j établit des liaisons hydrogène avec les résidus Tyr61 et Arg98 de gp16. Enfin, Thr77 de gp15 de la chaîne j-1 est impliqué dans deux liaisons hydrogène avec gp16 Gln39. De plus, Arg73 de la chaîne gp15 j forme un pont salin avec Glu95 de gp16 (Fig. 3f). Il a déjà été démontré que la perturbation de cette interaction par la mutation Arg73Glu dans gp15 empêche la liaison stable de gp16 à gp1520. Un deuxième type d'interactions entre gp16 et gp15 se produit par l'insertion de l'extrémité N-terminale de gp16 de la chaîne k + 1 dans un pli entre le tonneau β de gp15 et les boucles α2-β1 des chaînes gp15 j et j + 1, respectivement (Fig. 3g). Ce réseau d'interactions établit la transition de 12 à 6 fois la symétrie au sein du connecteur. Dans l'ensemble, l'interaction entre chaque sous-unité de gp16 et l'oligomère gp15 a une surface de 1040 Ų et une énergie de dissociation de -11, 3 kcal / mol (tableau supplémentaire 4) indiquant une liaison forte entre les oligomères gp15 et gp16.

La sous-unité gp16 dans le connecteur a un noyau de barillet β à huit brins bien défini (Fig. 1d) comme le monomère gp16 naïf d'assemblage (PDB 2KCA) en solution (Fig. 4a). Le changement le plus spectaculaire au sein de la structure gp16 se produit dans la boucle flexible β2'-β3 (résidus 43 à 51) qui se replie dans l'hélice tunnel α (Fig. 4a). Les hélices α de six sous-unités gp16 dans le connecteur sont maintenues ensemble par 5 liaisons hydrogène inter-sous-unités entre des sous-unités adjacentes. Gln43 en fait quatre et le cinquième se situe entre Tyr47-Glu45 (Fig. 4b). Les hélices tunnel forment une constriction dans le canal porte d'un diamètre d'environ 12 Å entre les chaînes latérales de résidus gp16 Gln51 opposés (Fig. 1d). C'est la seule région du tunnel connecteur plus étroite que le diamètre de 20 Å d'une double hélice d'ADN, bloquant l'ADN à l'intérieur de la capside après son encapsidation. L'interaction entre les sous-unités gp16 est particulièrement faible avec une surface de 510 Ų entre les sous-unités adjacentes et une énergie de dissociation calculée de -2 kcal/mol (tableau supplémentaire 4), ce qui suggère que les liaisons aux sous-unités gp15 jouent un rôle important pour maintenir l'hexamère gp16 dans le connecteur. L'extrémité N-terminale de la gp16 (résidus 12 à 30) forme la boucle β1-β2, qui dépasse sous le connecteur et interagit vraisemblablement avec la queue (Fig. 1d). La liaison de la queue à gp16 pourrait stabiliser davantage sa structure dans le phage infectieux à queue20.

a Comparaison de la structure RMN du monomère gp16 naïf d'assemblage (panneau de gauche, PDB 2KCA) avec une sous-unité de gp16 dans le connecteur (panneau central). L'extrémité N-terminale est représentée en bleu foncé (résidus 1 à 7) et la boucle β2'-β3 est en rouge (résidus 40 à 56). Le panneau de droite montre la superposition des deux structures gp16 alignées à travers leur noyau de feuille β. La structure RMN est en gris. b Hélices tunnel de deux sous-unités adjacentes de l'hexamère gp16 vues du côté de la capside. Les lignes pointillées noires montrent des liaisons hydrogène. La position de l'axe de symétrie d'ordre 6 est représentée par un hexamère noir.

La structure de résolution de 2,7 Å du complexe SPP1 gp612gp1512gp166 rapportée ici révèle l'architecture moléculaire détaillée du gardien complet de l'ADN viral des virus procaryotes à queue. La comparaison avec la structure de ses composants non assemblés révèle les événements moléculaires conduisant à l'assemblage du gatekeeper (Fig. 5) qui ont des implications fonctionnelles et évolutives étendues.

a Ancrage du monomère gp15 dans le clip gp6. Vingt modèles des structures RMN du monomère gp1519 sont superposés pour mettre en évidence des éléments structuraux stables et flexibles avant assemblage (panneau de gauche). L'extrémité N-terminale α0 et la boucle α2-α3 (représentées en vert et bleu, respectivement) subissent des changements de conformation lors de l'assemblage. a–c La liaison à gp6 des sous-unités gp15 adjacentes conduit à des conflits entre les boucles gp15 α2-α3 induisant des changements et le repliement de l'épingle à cheveux β1-β2 (la flèche bleue courbée en a indique le changement se produisant en b lors de l'oligomérisation), construisant le canon β intersous-unité gp15. Repositionnement des hélices α0 pendant l'oligomérisation (la flèche verte courbée en a montre le changement se produisant en b), pour ponter les hélices α1 des sous-unités adjacentes. Les vues du côté arrière dans la partie inférieure de la figure ne montrent que les sous-unités gp15 pour plus de clarté. d Liaison de gp16 à l'anneau gp15. Vingt modèles superposés de la structure RMN du monomère gp1619 sont présentés sur le panneau de gauche. L'extrémité N-terminale gp16 et la boucle β2'-β3, qui changent de conformation lors de l'assemblage, sont respectivement rendues en bleu foncé et en rouge. eh Repliement des boucles gp16 β2'-β3 en hélices tunnel stabilisées par des interactions inter-hélices suite à l'oligomérisation de gp16 dans le connecteur. Les vues sont présentées du côté de la queue du phage.

La structure du connecteur montre la conformation de la protéine portaile gp6 dans son état d'encapsidation post-ADN. Les emplacements des mutations qui arrêtent l'empaquetage de l'ADN avant le clivage endonucléolytique qui met fin au processus25,26 identifient des grappes de résidus fonctionnellement importants dans les éléments structurels de gp6 (Fig. 2e). Deux grappes ont été trouvées dans la couronne et dans les boucles qui bordent le tunnel du portail. D'autres mutations affectent les éléments structurels qui construisent la poche du clip exposée pour la liaison de la terminase (Fig. 2e et Fig. 3b supplémentaire). La découverte précédente selon laquelle le mouvement de l'hélice de la tige α5 est nécessaire pour l'empaquetage de l'ADN28 et la localisation des mutations dans la structure gp6 suggèrent que les boucles tunnel agissent de manière concertée avec la terminase pendant l'empaquetage de l'ADN27,29. Leur diaphonie à travers l'hélice α5 pourrait soutenir la translocation de l'ADN, entraînée principalement par l'activité de pompage de la terminase29, et un mécanisme à cliquet dans lequel les boucles tunnel agissent pour empêcher le glissement de l'ADN hors de la capside du phage lorsqu'il atteint une concentration élevée à l'intérieur de la capside. La fonction de cliquet précédemment proposée des boucles tunnel8, 32, 33, est en théorie coordonnée avec l'activité motrice d'emballage de l'ADN. Ce mécanisme de rétention opérant lors de l'encapsidation du génome est transitoire. Le maintien de l'ADN à l'intérieur de la capside nécessite la liaison de gp15 et gp16 au système portail lors du départ de la terminase10. Le processus est coordonné par une interaction séquentielle de la terminase et de gp15 avec une interface de liaison commune dans une poche du clip gp6 (Figs. 2e et 3a, b).

La comparaison des structures RMN de gp15 et gp1619 naïfs d'assemblage SPP1 avec leurs conformations dans le connecteur met en évidence les réarrangements structurels se produisant lors de l'assemblage du gardien d'ADN (Figs. 3c, 4a et 5). L'analyse des homologues structuraux gp15 et gp16 (Figs. 6 à 8 supplémentaires) élargit davantage notre compréhension de leur paysage conformationnel. Les protéines de type Gp15 ont un noyau α-hélicoïdal conservé mais diffèrent dans les conformations de la boucle α0-α1, de la boucle α2-α3 et/ou de l'extrémité C-terminale. Ces variations informent sur les changements structurels sur la voie du monomère à l'état dodécamère (Fig. 6 supplémentaire). L'extrémité C-terminale de SPP1 gp15 n'a une conformation définie que si elle est liée à la protéine porte. Cela corrobore son rôle dans l'ancrage des protéines adaptatrices de type gp15 au clip du portail (Fig. 5a). Lors de l'assemblage du connecteur, l'hélice gp15 α0 change de position pour une orientation plus horizontale (Figs. 3c et 5a, b). Fait intéressant, dans le monomère non assemblé de l'homologue gp15, YqbG34, l'hélice α0 adopte une position, stabilisée par des liaisons intrachaîne, proche de l'orientation trouvée à l'état de connecteur gp15 (Fig. 6b supplémentaire). Dans SPP1, une telle conformation nécessite une liaison inter-sous-unités de α0 qui relie les hélices α1 des sous-unités voisines (Fig. 3d). La perturbation de ces interactions dans le mutant gp15 Arg5Glu Arg8Glu (Fig. 3d) permet la formation du complexe gp15-g16 dans les capsides de phage mais empêche la fermeture du tunnel connecteur20. Le repositionnement de α0 est donc une étape essentielle de l'assemblage (étapes a à b de la Fig. 5 ; Film supplémentaire 1).

Les structures RMN des monomères gp15 et YqbG19,34 montrent toutes deux des boucles hautement mobiles α2-α3 (Fig. 6b supplémentaire). Leurs noyaux α-hélicoïdaux ont des interactions intra-sous-unités similaires. La protéine gp6 homologue du siphophage HK97 forme un cycle 13-mer dans des conditions naïves d'assemblage18 et la boucle α2-α3 de HK97gp618 a une interaction interchaîne de type β antiparallèle (Figs. 6b et 7a supplémentaires). Cette boucle est située dans une position similaire à la boucle α2-α3 de SPP1 gp15 qui se plie pour former une feuille β dans le connecteur (Figs. 6b et 7b supplémentaires). Bien que gp6 de HK97 forme très probablement un 12-mer lorsqu'il s'assemble dans la particule de phage18, la structure 13-mer suggère que son oligomérisation conduit à la formation d'interactions de type β entre les boucles α2-α3 des sous-unités adjacentes. Nous émettons l'hypothèse qu'ils représentent un état précurseur d'un barillet β inter-sous-unités dans HK97, comme cela a été trouvé dans SPP1 gp15. L'ajustement du corps rigide des monomères RMN gp15 dans le connecteur SPP1 expose de multiples conflits entre les boucles α2-α3 des sous-unités adjacentes, dictant des changements conformationnels dans leur pli. Ces changements entraînent vraisemblablement la formation du barillet β lors de l'oligomérisation de la gp15 (a à c sur la figure 5; Film supplémentaire 1). Collectivement, l'analyse des structures protéiques homologues de SPP1 gp15 révèle différentes conformations qui sont nécessaires pour atteindre l'état assemblé gp15 fonctionnel.

Le barillet gp15 β crée une plate-forme pour la fixation de gp16 au complexe portail SPP1 (Fig. 5d). Les bouchons de connecteur, caractérisés par gp16, sont caractérisés par un noyau β-barrel3 commun (Fig. 8 supplémentaire). Les monomères du phage λ gpFII17 (PDB 1K0H) et XkdH du prophage PBSX (PDB 3F3B) ont une boucle flexible équivalente à la boucle β2'-β3 du monomère SPP1 gp16. Cette boucle est pliée en une hélice α dans le monomère du bouchon putatif SF1141 (Fig. 8b supplémentaire). La boucle β2'-β3 de SPP1 gp16 se replie également en une hélice α après la liaison des sous-unités gp16 à l'anneau gp15 dans SPP1 (étapes f à h sur la figure 5; film supplémentaire 1). Cinq contacts inter-hélices stabilisent la conformation hélicoïdale obstruant le canal porte (Fig. 4b) tout en n'imposant pas une forte barrière à la rupture de cette liaison nécessaire à l'ouverture ultérieure du canal. La faible liaison intersous-unité gp16 (tableau supplémentaire 4) indique que son interaction avec gp15 joue un rôle majeur pour le positionnement approuvé des six sous-unités gp16 dans le connecteur. Cela corrobore les mutations de gp15 qui altèrent spécifiquement la fermeture du tunnel portail par gp1620 (voir ci-dessus). La transition de symétrie de 12 à 6 fois au sein du complexe gp15-gp16 permet une correspondance directe du connecteur avec la structure de la longue queue pré-assemblée du phage qui a une symétrie de rotation de 6 fois.

Le complexe de vertex porte représente une porte de trafic ADN essentielle conservée parmi tous les virus de la lignée virus à queue procaryote-herpèsvirus35. Le composant protéique portail est conservé dans la lignée. En revanche, les effecteurs agissant après l'encapsidation de l'ADN ont divergé à mesure que les virus évoluaient pour infecter différents hôtes cellulaires (Fig. 6). Les herpèsvirus eucaryotes ont fourni au clip protéique du portail des hélices α "tentacules" qui font saillie vers un capuchon qui ferme le système du portail4, 36 (Fig. 6). Les domaines de clip, comme dans SPP1 gp6, sont l'un des éléments structurels les plus conservés dans la protéine porte des bactériophages à queue3,14. Ces virus ont également des protéines de type gp15 qui forment des dodécamères prolongeant le tunnel porte de l'ADN. Cependant, la région du tonneau β de SPP1 gp15 a changé de manière significative dans les protéines homologues des phages à queue courte (Fig. 6). Les phages P68 et φ29 ont un barillet β plus long que 100 Å formant le conduit d'ADN à queue courte23,37 (Fig. 7c, d supplémentaires) tandis que T78 et éventuellement P2215 n'ont pas d'équivalent au barillet β SPP1 gp15 (Fig. 6). Cette divergence évolutive est en outre marquée par l'absence de protéines homologues de gp16 dans les phages à queue courte, à l'exception d'un domaine de la protéine gp923 du bouton de queue du phage φ29 (Fig. 8 supplémentaire). En revanche, les protéines de type gp16 sont conservées parmi les phages à longue queue38. L'architecture moléculaire de l'interface gp15-gp16 accomplit la transition de symétrie connecteur-queue et correspond à la structure gp15 formant un tunnel de connecteur avec le pli en forme de tube de queue de gp1639. Ce pli en tonneau β est la caractéristique commune de certains composants des tubes à longue queue39,40. Les protéines de type gp16 ont évolué pour établir trois fonctions principales : premièrement l'interaction avec les protéines de type gp15, deuxièmement pour construire un système de rétention temporaire de l'ADN viral, et troisièmement pour se lier à la protéine de jonction queue-tête à l'extrémité du tube de queue3,20,21,41,42. La haute résolution du complexe multi-protéine connecteur nous permet de révéler les résidus les plus importants impliqués dans les interactions entre les composants protéiques, comment la transition entre les différentes symétries a lieu et quels composants protéiques sont responsables de la régulation du transfert d'ADN par le canal principal du système.

La protéine porte (en gris-bleu) est conservée dans tous les virus de la lignée. La protéine adaptatrice (magenta clair) qui se lie au clip portail des virus procaryotes présente diverses caractéristiques structurelles dans la région distale du portail. Ils définissent deux points de division évolutive pour les virus à queue courte, typés par les phages T7 et φ29, à partir des phages à longue queue. Les protéines adaptatrices des phages à longues queues englobent un barillet β (magenta) pour la liaison des protéines d'arrêt (en vert). L'ajout d'un domaine de tourelle (en bleu) au portail et la perte de la protéine adaptatrice chez les herpèsvirus marquent leur divergence avec les virus procaryotes. Les domaines de la protéine portale du cytomégalovirus de l'herpès (HCMV) et des adaptateurs de phages à queue qui définissent les points de rupture dans la trajectoire évolutive de la lignée sont indiqués respectivement en bleu foncé et en magenta. Les structures présentées sont le connecteur SPP1 (gp612gp1512gp166; PDB 7Z4W ce travail), HCMV pUL10412 (PDB 7ETM), T7 gp812gp1112 (PDB 6R21) et φ29 gp1012gp1112 (PDB 6QZF). Des images représentatives d'une capside d'herpèsvirus et de particules de phage matures en coloration négative (acétate d'uranyle à 2 %) sont présentées à proximité des connecteurs correspondants. La barre d'échelle correspond à 50 nm.

L'architecture du connecteur et son mécanisme d'assemblage révèlent le processus évolutif de la lignée des virus procaryotes à queue-virus de l'herpès (Fig. 6). Dans les virus procaryotes à queue infectant les bactéries et les archées, il existe des protéines de type gp15 qui se lient au clip porte38,43. Leurs structures révèlent des points de ramification dans la lignée pour former des queues courtes ou pour connecter les protéines de type gp16 (Fig. 6). Cette dernière interaction crée une interface pour fixer les longs tubes de queue assemblés dans un chemin indépendant. Les procaryotes ont précédé les eucaryotes dans l'évolution. Nous émettons donc l'hypothèse qu'un virus ancestral à queue procaryote a évolué par insertion du domaine de la tourelle dans le clip portail et perte d'interaction avec la protéine adaptatrice pour donner naissance à l'ancêtre portail des virions des herpèsvirus eucaryotes (Fig. 6). Collectivement, notre structure de connecteur et notre étude de biologie structurale comparative découvrent le mécanisme moléculaire d'assemblage du gardien complet de l'ADN viral, fournissant un cadre moléculaire attendu depuis longtemps pour tracer la voie de divergence évolutive entre les herpèsvirus et différentes familles de phages à queue.

La purification du complexe connecteur SPP1 a été rapportée9. En bref, des particules sans queue SPP1 ont été produites par infection de l'hôte non permissif Bacillus subtilis YB886 avec le phage SPP1sus942,44 et purifiées par centrifugation isopycnique dans un gradient discontinu de CsCl45. Les particules sans queue ont été rompues avec 50 mM d'EDTA pendant 30 min à 55 °C. Ensuite, du MgCl2 a été ajouté à une concentration finale de 100 mM et l'ADN libre a été digéré pendant une nuit avec 50 U de benzonase dans un four à 37 °C. Les complexes connecteurs ont ensuite été purifiés par sédimentation à travers un gradient de glycérol de 10 à 30 % (p/v) dans un tampon TBT (Tris-Cl 100 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, MgCl2 10 mM) exécuté à 35 000 tr/min dans un rotor SW41 (Beckman Coulter) pendant 3 h à 4 °C. Les fractions contenant des connecteurs ont été identifiées par la présence de gp6, gp15 et gp16 dans SDS-PAGE et western blots9. Ils ont ensuite été regroupés, suivis d'une concentration et d'un tampon échangé contre du TBT 0,5x dans un micro concentrateur Vivaspin avec un seuil de coupure de 100 kDa.

3 μL de suspension de complexes connecteurs gp6gp15gp16 purifiés à 0,64 mg/mL ont été appliqués sur une grille C-flat fraîchement déchargée (ising PELCO Easiglow,Ted Pella, USA) (Protochips, USA; 2/2 400 mesh) et buvardés pendant 5 secondes avant de plonger les grilles et vitrifiés à l'aide d'un Vitrobot Mark IV (ThermoFisherTM) à 9 6 % d'humidité et 4 °C. Les données ont été recueillies sur un microscope Titan Krios (ThermoFisherTM, l'installation de source de lumière eBIC Diamond, Harwell, Oxfordshire, Royaume-Uni) fonctionnant à 300 kV avec l'échantillon maintenu à des températures d'azote liquide. Les images ont été enregistrées à l'aide d'une caméra Falcon III (ThermoFisherTM) en mode intégration qui permet une acquisition plus rapide des données. La collecte des données a été effectuée à l'aide du logiciel EPU (ThermoFisherTM) dans une plage de défocalisation de -1,2 à -2,5 μm. Des films (40 images par film) ont été collectés avec une dose de 1,12 e−/Å2 par image au plan de l'échantillon sur une exposition de 1 s. La taille de pixel calibrée était de 0,69 Å au niveau de l'échantillon.

3876 films ont été alignés à l'aide de MotionCorr246. CTFFIND447 a été utilisé pour déterminer les valeurs de défocalisation (Fig. 1 supplémentaire). Les micrographies ont été examinées manuellement pour évaluer la qualité du CTF et sélectionnées en fonction de la présence d'anneaux Thon haute résolution d'au moins 4 Å et au-delà pour un traitement ultérieur. Un ensemble de 10 micrographies sélectionnées au hasard a été utilisé pour la sélection manuelle des particules. Cinq classes 2D correspondant aux vues latérales ont ensuite été utilisées pour la sélection automatisée de particules à partir de l'ensemble des données. Environ 520 000 images de particules ont été extraites d'environ 3 500 micrographies à l'aide de Relion 2.048. La correction de la fonction de transfert de contraste a été effectuée par retournement de phase lors du traitement suivant.

Les premières étapes de traitement ont été effectuées dans Relion 2.0. L'ensemble de données d'images de particules a été soumis à 3 cycles de classification 2D pour supprimer les images atypiques qui comprenaient une contamination par la glace, des particules qui se chevauchaient ou étaient attachées aux limites du cadre. Les meilleures classes représentant principalement des vues latérales (~ 10 000 images) ont été sélectionnées dans un premier temps pour les alignements initiaux et la reconstruction. La carte gp6 de la protéine portale (EMD-1021)10 filtrée passe-bas à 20 Å, qui a révélé la symétrie C12, a été utilisée comme modèle initial. Ensuite, nous avons effectué une classification 3D en 5 classes. Aucune symétrie n'a été appliquée lors de ces étapes d'analyse. Deux classes n'étaient pas bien définies, deux classes étaient plutôt similaires avec une symétrie C12 apparente et la dernière avait une structure en miroir avec une symétrie d'environ 12 fois.

Les deux structures avec la bonne latéralité, évaluées en ajustant les domaines principaux d'une sous-unité de la structure de rayons X gp6 13 mer (PDB 2JES) 12, ont été moyennées et utilisées comme modèle de départ pour obtenir la structure du complexe connecteur en utilisant l'ensemble de données complet de 520 000 particules. Plusieurs itérations de raffinement 3D alternées avec la classification 3D ont abouti à une structure à une résolution d'environ 3, 5 Å.

Dans les prochaines étapes de raffinement, nous avons utilisé un sous-ensemble d'images de film de 2 à 21 après leur alignement pour éliminer les images à forte dose de rayonnement et les images de particules ré-extraites. Ces images et le modèle obtenu dans Relion 2.0 ont été exportés dans CryoSPARC49 pour un traitement ultérieur. Après trois cycles de classification 2D dans CryoSPARC, 401 807 images de particules ont été sélectionnées pour les deux prochains cycles de raffinement. La structure du complexe gp6gp15gp16 à symétrie imposée C12 indiquait que la densité de la région correspondant à la protéine gp16 était presque deux fois inférieure par rapport aux densités de gp6 et gp15. Cette découverte a indiqué que les composants protéiques dans le connecteur ont des symétries différentes. Par conséquent, nous avons réduit la symétrie pour étudier la distribution des densités correspondant à chaque composant protéique. L'utilisation de la symétrie triple a révélé six sous-unités dans la région de gp16, ce qui implique que le cycle gp16 a une symétrie C6. Cette symétrie a été utilisée lors du raffinement final de la structure complexe. Les densités de cryo-électrons correspondant à chacune des trois protéines étaient dans la même gamme dans la structure obtenue.

La structure finale du complexe a été obtenue à une résolution de 2,4 Å telle qu'estimée par la corrélation de coquille de Fourier (FSC) de référence à un seuil de 0,143 et 2,7 Å à un seuil de 0,5. Les variations de résolution locales dans la reconstruction ont été estimées à l'aide de ResMap50 (Fig. 2d supplémentaire).

L'interprétation de la carte cryoEM a été effectuée à l'aide de Chimera51, COOT52 et PHENIX53. La construction initiale du modèle atomique pour gp6 a été réalisée par ajustement de corps rigide du domaine de la tige (hélices α3 et α5, résidus 256–280 et 327–368 de la structure aux rayons X d'un anneau gp6 13-mer, PDB 2JES12). Les acides aminés restants de la séquence ont été ajustés de novo par traçage manuel à l'aide de COOT avec des ajustements approfondis du modèle aux densités cryoEM. Cette étape a été suivie d'un raffinement dans l'espace réel du modèle atomique par rapport à la carte expérimentale dans PHENIX, y compris les contraintes pour les rotamères, le c-bêta et les contraintes de Ramachandran. Notez que le court brin β β10 (résidus 215 à 217) ne se trouve que dans les chaînes A, C, E, G, I et K en raison de la faible densité cryo-électronique locale dans l'aile gp6. Les modèles atomiques de gp15 et gp16 ont été construits de novo dans la carte cryoEM. Les séquences d'acides aminés ont été tracées manuellement avec COOT et le raffinement de l'espace réel avec PHENIX dans la carte de densité cryoEM.

Des modèles atomiques raffinés de chaque protéine du complexe connecteur ont été obtenus par plusieurs cycles de reconstruction dans COOT et de raffinement de l'espace réel avec des contraintes rotamère, c-bêta et Ramachandran dans PHENIX. L'inspection manuelle des résidus dans le traçage complet des chaînes polypeptidiques gp6, gp15 et gp16 a été effectuée à l'aide de COOT pour corriger l'orientation des rotamères et pour tracer les régions de qualité de densité cryo-électronique inférieure (résidus gp6 170–176 et 217–241). Les résidus protéiques du modèle atomique final présentent des paramètres géométriques bien affinés : régions les plus favorisées, 91,71 % ; en outre, régions autorisées, 8,18 % ; et 0,10% de valeurs aberrantes dans les parcelles de Ramachandran (tableau supplémentaire 1). La liaison inter-sous-unités, les interfaces d'interaction et l'énergie de dissociation des sous-unités dans le complexe connecteur ont été calculées à l'aide de PISA30 (tableaux supplémentaires 3 et 4). Le potentiel électrostatique des interfaces protéiques a été calculé et affiché à l'aide de Pymol54.

Des recherches d'homologie de structure ont été effectuées avec DALI55 en utilisant des sous-unités individuelles du connecteur (ce travail) et les structures RMN de gp15 et gp1619. La comparaison de structure par paires entre les domaines de gp6 dans le connecteur (ce travail) et dans le gp6 naïf d'assemblage (PDB 2JES12) a été effectuée avec le serveur DALI55 en utilisant les paramètres par défaut. Les coordonnées PDB des domaines correspondants ont été fournies en entrée. Les coordonnées Ca de la chaîne polypeptidique dans les domaines ont été utilisées pour le calcul de la RMSD.

Les figures ont été préparées à l'aide des logiciels Pymol54 et Chimera51.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données à l'appui de cette étude sont disponibles auprès des auteurs correspondants sur demande raisonnable. Les coordonnées des modèles atomiques ont été déposées dans la Protein Data Bank sous le code d'accès 7Z4W (complexe gp612 - gp1512 - gp166) et la carte de densité de microscopie électronique correspondante a été déposée dans la banque de données de microscopie électronique sous le code d'accès EMD-14509 (complexe gp612 - gp1512 - gp166).

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Nous remercions le Dr D. Houldershaw et Y. Goudetsidis pour le soutien informatique à Birkbeck pendant toute la durée du projet. Les échantillons Cryo-EM ont été préparés et optimisés à l'installation ISMB EM du Birkbeck College, avec le soutien financier de Wellcome Trust (079605/2/06/2). Nous reconnaissons Diamond Light Source pour l'accès et le soutien des installations cryo-EM du UK National Electron Bio-Imaging Center (eBIC, sous la proposition EM14704) financé par le Wellcome Trust, le Medical Research Council UK et le Biotechnology and Biological Sciences Research Council. Nous remercions le Dr Y. Chaban pour son aide dans la collecte des données au eBIC. Nous remercions le Dr A. Isidro (VMS, CNRS, Gif-sur-Yvette, France) pour un échantillon de capsides C du HSV-1 et le Dr R. Lurz (MPIMG, Berlin, Allemagne) pour avoir aimablement fourni les micrographies présentées à la Fig. 6. Une partie de ce travail a été soutenue par un financement institutionnel du CNRS.

Igor Orlov

Adresse actuelle : University of Glasgow, Scottish Centre for Macromolecular Imaging, Sir Michael Stoker Building, 464 Bearsden Road, Glasgow, G61 1QH, Écosse, Royaume-Uni

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Igor Orlov, Stéphane Roche.

Centre de Biologie Intégrative (CBI), Département de Biologie Structurale Intégrée, IGBMC, Université de Strasbourg, 67404, Illkirch, France

Igor Orlov

Université Paris-Saclay, CEA, CNRS, Institute for Integrative Biology of the Cell (I2BC), 91198, Gif-sur-Yvette, France

Stéphane Roche, Sandrine Brasilès & Paulo Tavares

Institut de biologie structurale et moléculaire, Département des sciences biologiques, Birkbeck College, Malet Street, Londres, WC1E 7HX, Royaume-Uni

Natalya Lukoyanova & Elena V. Orlova

Institut Pasteur, Université Paris Cité, CNRS UMR3569, Unité de Virologie Structurale, 75015, Paris, France

Marie-Christine Vaney

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EVO et PT ont conçu et supervisé la recherche. Capsides et connecteurs remplis d'ADN SPP1 purifiés par SB. NL a préparé les grilles EM, IO, EVO ont analysé les données EM et effectué une analyse structurelle. IO, EVO, SR et MC.V. analysé la carte et effectué la modélisation. PT, EVO et SR ont rédigé le manuscrit ; IO, EVOSR et M.-CV ont préparé les chiffres. Tous les auteurs ont participé aux discussions sur les résultats, les chiffres et la lecture critique du manuscrit. Tous les auteurs ont approuvé la version finale du manuscrit.

Correspondance à Paulo Tavares ou Elena V. Orlova.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Les animaux, les participants humains ou leurs tissus n'ont pas été impliqués ou utilisés dans cette étude. Aucun essai clinique n'a été inclus.

Nature Communications remercie Lotta Happonen, Carolyn Teschke et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International License, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, tant que vous donnez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Orlov, I., Roche, S., Brasilès, S. et al. Structure CryoEM et mécanisme d'assemblage d'un gardien du génome d'un virus bactérien. Nat Commun 13, 7283 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-34999-8

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Reçu : 17 juin 2022

Accepté : 15 novembre 2022

Publié: 26 novembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-34999-8

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