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Jan 07, 2024

La liaison au substrat dans le transporteur ADP/ATP mitochondrial est une étape

Volume Communication Nature

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 3585 (2022) Citer cet article

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Les porteurs mitochondriaux d'ADP/ATP importent l'ADP dans la matrice mitochondriale et exportent l'ATP vers le cytosol pour alimenter les processus cellulaires. Les structures des états inhibés du cytoplasme et de la matrice ouverte ont confirmé un mécanisme de transport d'accès alterné, mais les détails moléculaires de la liaison au substrat restent non résolus. Ici, nous évaluons le rôle des résidus exposés au solvant de la voie de translocation dans le processus de liaison au substrat. Nous identifions le site de liaison principal, composé de trois résidus chargés positivement et d'un ensemble de résidus aliphatiques et aromatiques, qui se lient à l'ADP et à l'ATP dans les deux états. De plus, il existe deux paires de résidus asparagine/arginine sur les côtés opposés de ce site qui sont impliqués dans la liaison au substrat d'une manière dépendante de l'état. Ainsi, les substrats sont dirigés à travers une série de poses de liaison, induisant les changements conformationnels du porteur qui conduisent à leur translocation. Les propriétés de ce site expliquent le caractère électrogène et réversible du transport des nucléotides adénine.

La viabilité et la fonction des cellules eucaryotes reposent sur le transport de métabolites et d'ions à travers la membrane interne mitochondriale imperméable afin de maintenir les voies métaboliques de la mitochondrie et du cytosol et de fournir des composés pour la maintenance organellaire et cellulaire. La majorité de ces composés sont transportés par la famille des porteurs mitochondriaux (SLC25), qui est la plus grande famille de porteurs de solutés chez l'homme1,2,3. Le transporteur ADP/ATP mitochondrial, également appelé adénine nucléotide translocase, effectue l'une des étapes de transport les plus prolifiques du corps humain. Le transporteur importe l'ADP cytosolique dans la matrice mitochondriale pour la conversion en ATP par l'ATP synthase et il exporte l'ATP vers l'espace intermembranaire, qui est confluent avec le cytoplasme, pour alimenter les processus nécessitant de l'énergie de la cellule, en tant que partie intégrante de la phosphorylation oxydative4. Le porteur alterne entre deux états, qui sont classiquement appelés état ouvert de matrice et état ouvert cytoplasmique, en raison de l'orientation du site de liaison au substrat vers ces compartiments5,6. Les études fonctionnelles et structurelles ont été facilitées par la disponibilité d'inhibiteurs spécifiques à l'état. Le support est bloqué dans un état cytoplasmique ouvert par l'atractyloside (ATR)7 et le carboxyatractyloside (CATR)8,9, alors qu'il est bloqué dans un état ouvert sur la matrice par l'acide bongkrekique (BKA)10,11,12. Les deux états liés à l'inhibiteur sont abortifs car l'inhibition est obtenue en empêchant la liaison au substrat et en piégeant le porteur dans une conformation structurelle qui ne fait pas partie du cycle de transport5,6.

Comme la plupart des membres de SLC25, le transporteur ADP/ATP consiste en trois séquences répétées homologues d'environ 100 acides aminés chacune13, qui se replient en une structure pseudo-symétrique triple avec une voie de translocation centrale pour les substrats14. La structure atomique du transporteur ADP/ATP bovin à l'état ouvert cytoplasmique lié au CATR a montré que chaque répétition de séquence code pour un domaine constitué d'une hélice α transmembranaire impaire (H1, H3, H5), d'une boucle contenant une hélice courte (h12, h34, h56) parallèle à la membrane côté matrice et d'une hélice α transmembranaire paire (H2, H4, H6)15 (Supp. Fig. 1). Cette topologie de base a été confirmée par les structures atomiques des transporteurs ADP/ATP fongiques verrouillés dans l'état ouvert cytoplasmique lié à CATR et dans l'état ouvert matriciel lié à BKA.

Dans chacun des trois domaines, l'hélice impaire, l'hélice matricielle et la partie N-terminale de l'hélice paire vers le «point de contact»17,18,19 constituent l'élément central, tandis que la partie C-terminale de l'hélice paire forme l'élément de porte17 (Fig. 1 supplémentaire). L'interconversion entre les deux états se produit de manière alternée20 et implique des mouvements importants des six éléments structuraux, faisant du transporteur ADP/ATP le transporteur de soluté le plus dynamique identifié à ce jour5,17. Les trois éléments de porte ouvrent et ferment le côté cytoplasmique du support, tandis que les trois éléments centraux ferment et ouvrent le côté matrice, alternativement. L'ouverture et la fermeture sont régulées par la perturbation et la formation de deux réseaux et accolades de ponts salins : le réseau de ponts salins matriciels du motif [PS]x[DE]xx[KR]15,16 et l'accolade glutamine16 sur les éléments centraux et le réseau de ponts salins cytoplasmiques du motif [FY][DE]xx[RK]17,20,21 et les accolades tyrosine17 sur les éléments de porte (Fig. 1 supplémentaire). Le mouvement coordonné de ces six éléments structurels est entraîné par la liaison et la libération du substrat en tant que seule source directe d'apport d'énergie22,23.

Dans le cycle de transport, la liaison au substrat et les changements de conformation sont des processus interdépendants, ce qui signifie qu'il doit y avoir une série continue d'états liés au substrat hautement dynamiques : de l'état cytoplasmique ouvert, via un état occlus, à l'état ouvert de la matrice, et retour. Au cours de ce processus, les molécules d'ADP et d'ATP peuvent adopter de nombreux conformères différents, car le porteur passe d'une conformation à l'autre. Par conséquent, il est nécessaire de démêler ce processus complexe, avant de pouvoir l'aborder par des analyses structurelles directes.

Des études biochimiques utilisant des analogues de nucléotides non transportables, menées avant la disponibilité des structures, ont proposé des sites de liaison au substrat dans les boucles matricielles24,25,26,27 et la région C-terminale27. Plus tard, des analyses de séquence, qui utilisaient des contraintes chimiques et de distance18,19 ou une déviation de pseudo-symétrie20 comme concepts, ont pointé vers un emplacement dans la partie centrale de la cavité, qui comprenait trois "points de contact"18,19 (Fig. 1 supplémentaire). En revanche, les simulations de dynamique moléculaire ont mis en évidence des interactions de substrat tout au long de la voie de translocation28,29,30,31. De toute évidence, les différentes études n'ont pas mis en évidence un emplacement consensuel pour le site de liaison au substrat, et sa détermination expérimentale sera donc une première étape essentielle pour résoudre les problèmes clés de liaison au substrat et de couplage conformationnel du transporteur mitochondrial ADP/ATP.

Ici, nous fournissons l'identification expérimentale directe des résidus impliqués dans la liaison au substrat en combinant des essais fonctionnels avec des études de liaison, en utilisant des mutants de remplacement d'alanine de la voie de translocation du substrat (Fig. 1). Notre approche identifie tous les résidus qui interagissent avec les substrats, quel que soit l'état conformationnel. L'identification des résidus du site de liaison fournit le cadre pour résoudre les détails moléculaires importants du mécanisme de liaison et de transport. Il est important de noter que les résidus impliqués dans la liaison de l'ADP et de l'ATP sont les mêmes, ce qui explique la nature électrogénique entièrement réversible du transport.

a Vue membranaire du modèle d'homologie de TtAac à l'état cytoplasmique ouvert (à gauche) et de la structure déterminée expérimentalement de TtAac à l'état de matrice ouverte (à droite) (code PDB : chaîne 6gci A). Les résidus analysés dans cette étude sont indiqués par des bâtons jaunes, tandis que les résidus des réseaux matriciels et cytoplasmiques sont des bâtons noirs, avec des interactions ioniques représentées par des tirets magenta. Les surfaces accessibles à l'eau, déterminées par HOLE59, sont représentées en bleu transparent. b Les résidus des hélices transmembranaires bordant la voie de translocation, analysés dans cette étude, sont marqués en bleu et les résidus des réseaux de ponts salins en noir.

Afin d'identifier les résidus qui pourraient être impliqués dans la liaison au substrat, nous avons analysé les résidus accessibles à l'eau dans le support mitochondrial ADP/ATP du champignon Thermothelomyces thermophila (TtAac), qui est plus stable dans les détergents que les orthologues de levure32. Pour identifier tous les résidus candidats, nous avons utilisé la structure ouverte de matrice déterminée expérimentalement de TtAac17 et un modèle d'homologie comparative de l'état ouvert cytoplasmique, basé sur les structures résolues de l'état ouvert cytoplasmique (entrées PDB 1okc, 4c9h, 4c9q et 4c9j). Au total, 36 résidus ont été identifiés dans la voie de translocation, englobant tous les résidus accessibles aux solvants à l'exception des deux réseaux de ponts salins, qui sont universellement conservés, quelle que soit la spécificité du substrat, et ont un rôle défini dans le mécanisme15,16,17,20,21 (Fig. 1). Chacun des résidus sélectionnés a été remplacé par l'alanine, générant un ensemble de 36 variants.

Tout d'abord, nous avons réalisé des études de complémentation fonctionnelle en utilisant la souche WB-12 déficiente en transport de Saccharomyces cerevisiae33. L'expression de TtAac de type sauvage a complètement restauré la croissance de WB-12 (complémentation à 100%), tandis que le contrôle, contenant un vecteur vide, n'a montré aucune croissance (Fig. 2 supplémentaire). Sur les 36 variantes d'alanine, seules cinq ont complété la croissance dans une mesure similaire à celle du type sauvage, tandis que 19 n'ont montré aucune croissance (<3%) et 12 autres ont montré une croissance significativement réduite (allant de 18 à 76%) (Fig. 2a, Fig. 2 supplémentaire). Les 19 résidus essentiels à la fonction sont dispersés dans toute la cavité centrale (Fig. 2b) et sont hautement conservés parmi les orthologues porteurs d'ADP/ATP (Fig. 3 supplémentaire). Les résidus chargés K30, R88, R197, R246 et R287 se sont déjà révélés importants pour la croissance et l'activité de transport dans d'autres orthologues34,35,36,37,38,39. Ces données ont montré que la plupart des résidus dans la voie de translocation sont importants pour un échange ADP/ATP efficace.

a Pourcentage de complémentation fonctionnelle de la souche WB-12 exprimant des variants TtAac par rapport à l'expression du porteur de type sauvage (complémentation à 100%), tel que déterminé par densitométrie de tests ponctuels de dilution en série sur milieu YPG (Fig. 2 supplémentaire). Les barres et les barres d'erreur représentent la moyenne et l'écart type de quatre expériences indépendantes. L'analyse de signification a été réalisée avec des tests t bilatéraux à un échantillon, comme décrit dans "Méthodes" (p > 0,05, ns ; p ≤ 0,05, * ; p ≤ 0,01, ** ; p ≤ 0,001, *** ; p ≤ 0,0001, ****). Les couleurs représentent les trois propriétés de croissance observées : croissance non affectée de manière significative (ns), bleu clair ; croissance significativement affectée (0,5 ≥ p > 0,0001), marine ; pas de croissance (p ≤ 0,0001), bleu foncé. b Position des résidus analysés dans la structure TtAac liée à la BKA ouverte à la matrice (code PDB : 6gci chaîne A), représentée sous forme de dessin animé. Les sphères représentent les atomes de carbone CA et sont codées par couleur comme décrit en a. Les données source de cette figure sont fournies sous forme de fichier de données source.

Les tests de complémentation ne permettent pas de déterminer quel aspect de la structure ou de la fonction est affecté par la mutation. La faible affinité de liaison des substrats (gamme μM23), un aspect crucial du mécanisme de transport, exclut l'utilisation de tests de liaison. Comme les tests de complémentation ne peuvent pas identifier les résidus impliqués spécifiquement dans la liaison au substrat, nous avons utilisé un test de décalage de thermostabilité, qui surveille le déploiement d'une population de protéines avec la sonde réactive au thiol 7-diéthylamino-3-(4-maléimidophényl)-4-méthylcoumarine (CPM) dans une rampe de température40. Une température de fusion apparente (Tm) peut être obtenue comme paramètre de thermostabilité32 au point où la vitesse de dépliage est maximale. Le test CPM peut être utilisé pour évaluer l'état de repliement et la stabilité des protéines membranaires dans différentes conditions32,41,42. De plus, les changements dans les profils de thermostabilité fournissent des informations sur la liaison des inhibiteurs17,21,32,43 et d'autres effecteurs44. Récemment, il a été démontré que des changements peuvent également se produire lors de la liaison de substrats aux protéines de transport32,45, car des interactions spécifiques se forment entre la protéine et les molécules de substrat45. En principe, la perturbation de ces interactions par des mutations conduirait à une diminution du décalage de thermostabilité induit par le substrat, fournissant un moyen d'identifier les résidus directement impliqués dans la liaison au substrat.

Pour mener les expériences de décalage de thermostabilité, nous avons utilisé des protéines purifiées, exprimées dans la souche de levure W303-1B, qui ont permis la surexpression de l'ensemble des 36 variants, quelle que soit leur activité fonctionnelle. Toutes les variantes ont été exprimées à des niveaux similaires et ont été correctement ciblées sur les mitochondries. Ils ont été purifiés avec succès à l'aide d'une liaison par affinité au nickel et d'un clivage par étiquette d'affinité sur colonne (Fig. 4 supplémentaire). Leur état de repliement et leur intégrité structurelle ont été évalués avec des tests CPM en présence et en l'absence des inhibiteurs spécifiques CATR et BKA17, 21, 32 (Fig. 3). La stabilité de la plupart des mutants n'a pas été affectée par les mutations individuelles, car leur Tm apparente n'était pas significativement différente (48, 2–52, 8 ° C) du type sauvage (50, 2 ± 0, 6 ° C) (Fig. 3a). Les exceptions étaient les variantes L41A, Q44A, T146A, Y239A et N284A, qui étaient dans un état déplié, à en juger par la fluorescence initiale élevée et l'absence de courbe de dépliement sigmoïde (Fig. 5a supplémentaire). Notamment, tous ces résidus sont situés dans la porte de la matrice (Fig. 5b, c supplémentaires). La porte matricielle fournit une couche isolante, empêchant la dissipation de la force motrice du proton par fuite de proton, lorsque le support est à l'état cytoplasmique ouvert17. De plus, le résidu Q44 est l'accolade glutamine entre H1 et H516.

une donnée de thermostabilité CPM de chaque protéine en l'absence d'effecteurs (en haut), ou en présence de CATR (au milieu) ou de BKA (en bas). Les barres et les barres d'erreur représentent la moyenne et l'écart type de l'échantillon de huit expériences indépendantes pour le type sauvage et 2 à 7 pour les variantes. L'analyse de signification pour chaque condition a été réalisée avec une ANOVA unidirectionnelle, comme décrit dans "Méthodes". Seuls les significatifs sont indiqués (p > 0,01, ns ; p ≤ 0,01, * ; p ≤ 0,001, ** ; p ≤ 0,0001, *** ; p ≤ 0,00001, ****). b Vue latérale de la structure à l'état ouvert cytoplasmique de ScAac2 en complexe avec CATR (code PDB : 4c9h chaîne A). Les résidus d'interaction de ScAac2 sont conservés dans TtAac, à l'exception de K104 qui est R100 dans TtAac et les deux protéines partagent une identité de séquence de 74 %. Pour faciliter la comparaison, nous avons utilisé le marquage TtAac (Fig. 3 supplémentaire). Les résidus qui forment des interactions ioniques (tirets jaunes) et des contacts hydrophobes avec le CATR (marin) sont représentés respectivement en bleu foncé et en marron. Le résidu K104 de ScAac2 a été modélisé en Arg (R100) pour TtAac. c Vue matricielle de la structure matricielle ouverte de TtAac avec BKA lié (code PDB : chaîne 6gci A). Les résidus qui forment des interactions ioniques (tirets jaunes) ou des liaisons hydrogène (tirets noirs) avec BKA (orange) sont représentés en violet, tandis que les résidus qui forment des contacts hydrophobes sont représentés en cyan. Les données source de cette figure sont fournies sous forme de fichier de données source.

Il est important de noter que les 31 variants repliés, à partir de l'état sans ligand, pouvaient se lier aux deux inhibiteurs, comme le montrent les changements vers des valeurs de Tm apparentes plus élevées, confirmant que les porteurs sans ligand étaient repliés. Ce n'est que lorsque le résidu muté participe à des interactions spécifiques avec l'inhibiteur qu'une réduction ou une suppression du décalage thermique est observée. De cette manière, il a été possible de cartographier les sites de liaison des inhibiteurs (Fig. 3b, c), ce qui concordait bien avec la plupart des interactions observées dans les structures des états liés à CATR et BKA15,16,17. L'accord est remarquable, compte tenu du fait que les données de thermostabilité sont mesurées avec des porteurs en solution à des températures comprises entre 25 et 90 °C, alors que les structures cristallines sont déterminées dans l'azote liquide à -196 °C. Certaines divergences apparentes appellent des commentaires supplémentaires. La structure bovine15 montre que les résidus équivalents de K30 et R246 interagissent avec CATR via des eaux ordonnées, en accord avec les déplacements réduits observés pour les variants d'alanine pertinents (Fig. 3b). Les résidus L135 et V138 pourraient former des contacts de van der Waals avec le groupe isovalérique de CATR. En cas de BKA, les mutants F97A, R100A, N123A, Y204A et L295A ont présenté un décalage significativement réduit, même si ces résidus ne participent pas directement à sa liaison. Ils font partie des accolades tyrosine et du bouchon hydrophobe de l'état ouvert de la matrice17, et sont donc essentiels à sa formation, une exigence pour la liaison de BKA. Une observation similaire a été faite pour les résidus composant le réseau cytoplasmique21. Dans l'ensemble, l'analyse des inhibiteurs a fourni la preuve de principe que ce test peut être utilisé pour détecter les résidus impliqués dans les interactions protéine-ligand. De plus, les données de thermostabilité ont prouvé collectivement que, à l'exception de cinq variantes (Fig. 5 supplémentaire), toutes les protéines non ligandées étaient bien repliées et adaptées aux analyses de liaison au substrat.

Nous avons ensuite déterminé une plage de concentration appropriée pour caractériser les changements de thermostabilité induits par le substrat en utilisant les porteurs sans ligand. Les décalages ont été exprimés sous la forme d'une valeur ΔTm, calculée en soustrayant la Tm apparente, spécifique de la protéine, en l'absence de substrat de la Tm apparente à chaque concentration de substrat. En accord avec des travaux antérieurs45, les valeurs de ΔTm du type sauvage ont augmenté de manière concentration-dépendante, jusqu'à saturation à 12 mM (ΔTm = 8,9 ± 1,8 °C) (Fig. 6 supplémentaire). Sur la base de cette expérience de titrage, cinq concentrations représentatives d'ADP et d'ATP (0,1, 0,5, 1, 5, 10 mM) ont été sélectionnées pour tester la réponse des variants. Nous notons que ces mesures ne fournissent pas une évaluation cinétique, car les taux d'activation et de désactivation du substrat augmentent avec l'augmentation des températures et parce que le dépliement et le marquage des protéines sont irréversibles. Le plateau se produit parce que la liaison au substrat ne peut pas empêcher le déploiement à ces températures élevées.

Nous avons ensuite mesuré les changements de thermostabilité en présence d'ADP et d'ATP pour les 31 variantes repliées. En ce qui concerne leur réponse au substrat, ils ont été classés en trois classes (Figs. 4, 5). Dans la première classe, les variantes K30A, R88A, R197A, R246A et R287A n'ont montré aucun changement de thermostabilité dépendant de la concentration en présence de l'un ou l'autre substrat (Fig. 4a), indiquant que chacun de ces résidus forme une interaction critique avec le substrat. Les variants n'ont systématiquement montré aucune croissance dans les tests de complémentation (Fig. 2a, Fig. 2 supplémentaire). Ces résidus chargés positivement se trouvent au milieu de la cavité remplie d'eau (Fig. 4c) et leur remplacement par l'alanine entraîne la perte d'une charge positive.

a, b Valeurs de décalage de thermostabilité (ΔTm) déterminées à une concentration de substrat de 0,1, 0,5, 1, 5, 10 mM pour les variantes de remplacement de type sauvage et d'alanine unique. Les cercles et les barres d'erreur représentent la moyenne et l'écart type de huit expériences indépendantes pour le type sauvage et 3 à 7 pour les variantes. Les cercles vides et pleins représentent respectivement l'ADP et l'ATP. Les données pour la protéine de type sauvage sont indiquées en noir, tandis que celles des variantes sont indiquées en rouge (a) ou en orange (b) pour les résidus critiques et importants, respectivement. Notez que pour plusieurs points de données, la valeur moyenne et les barres d'erreur des groupes ADP vs ATP sont identiques et, par conséquent, leur représentation graphique est superposée, avec le marqueur ADP en haut. Les barres d'erreur sont parfois masquées par le symbole . Les différences significatives ont été évaluées par ANOVA à deux facteurs avec interaction, comme décrit dans "Méthodes". Les valeurs significatives (p ≤ 0,01) sont indiquées par * ou # pour l'ADP et l'ATP, respectivement. c Structure liée à la BKA ouverte à la matrice TtAac (code PDB : chaîne 6gci A) (à gauche) et vue rapprochée (à droite) montrant les résidus analysés en bâton et sphère rouges ou oranges pour les représentations Gly. Les hélices sont montrées dans une représentation de dessin animé de blé et sont étiquetées. Les données source de cette figure sont fournies sous forme de fichier de données source.

a, b Valeurs de décalage de thermostabilité (ΔTm) déterminées à une concentration de substrat de 0,1, 0,5, 1, 5, 10 mM pour les variantes de remplacement de type sauvage et d'alanine unique. Les cercles et les barres d'erreur représentent la moyenne et l'écart type de huit expériences indépendantes pour le type sauvage et 3 à 5 pour les variantes. Les cercles vides et pleins représentent respectivement l'ADP et l'ATP. Les données pour la protéine de type sauvage sont affichées en noir, tandis que les données de variante sont affichées en vert. Notez qu'à plusieurs reprises, la valeur moyenne et les barres d'erreur des groupes ADP vs ATP sont identiques et, par conséquent, leur représentation graphique est superposée, avec le marqueur ADP en haut. Les barres d'erreur sont plus petites que le symbole lorsqu'elles ne sont pas affichées. L'évaluation statistique a été effectuée comme décrit dans "Méthodes". Les valeurs significatives (p ≤ 0,01) sont indiquées par * ou # pour l'ADP et l'ATP, respectivement. c Structure liée à la BKA ouverte à la matrice TtAac (code PDB: chaîne 6gci A) (à gauche) et vue rapprochée (à droite) montrant les résidus analysés dans le bâton vert et la sphère pour les représentations Gly. Les hélices sont montrées dans une représentation de dessin animé de blé et sont étiquetées. Les données source de cette figure sont fournies sous forme de fichier de données source.

La deuxième classe de variants de remplacement de l'alanine impliquait six résidus (N85, N96, L135, V138, G192 et Y196), qui se trouvaient à proximité des cinq résidus critiques et présentaient des profils de thermostabilité considérablement modifiés par rapport au type sauvage (Fig. 4b). Ces variants ont montré des changements dépendant de la concentration en présence de substrat, mais ils étaient significativement plus petits que ceux de la protéine de type sauvage. Des différences significatives ont été principalement obtenues pour les deux concentrations les plus élevées testées, à la fois pour l'ADP et l'ATP (Fig. 4b). Etant donné que les déplacements induits par le substrat n'ont pas été complètement abolis, chaque résidu apporte une contribution à la liaison au substrat. À l'appui de leur rôle contributif, les variantes L135A, G192A et Y196A n'ont pas du tout augmenté dans l'étude de complémentation (<3%), alors que N85A, N96A et V138A ont augmenté de manière significative moins (42 ± 23%, 18 ± 10% et 53 ± 14% respectivement) (Fig. 2a, Fig. 2 supplémentaire). Notamment, le remplacement de l'alanine n'a provoqué aucune instabilité protéique ni aucun trouble de la poche de liaison (Fig. 3) pour aucune des onze variantes de ces deux classes, soulignant que les effets observés sont en effet spécifiques de la liaison au substrat.

Il est important de noter que la troisième classe de variants impliquait 20 des 31 variants, qui présentaient des changements induits par le substrat qui n'étaient pas significativement différents de ceux de la protéine de type sauvage (Fig. 5). Les changements de thermostabilité des protéines mutantes S29A, V230A, G288A et G291A n'étaient pas différents du type sauvage à n'importe quelle concentration d'ADP et d'ATP (Fig. 5a), et ces variants étaient entièrement fonctionnels (Fig. 2a, Fig. 2 supplémentaire). Bien que les variants F97A, S189A, Y204, G235A et L295A n'aient pas complété la croissance et que T92A, Q93A, R100A, S134, Y200A, T231A et S238A n'aient été complétés que partiellement (Fig. 2a, Fig. 2 supplémentaire), ils avaient tous des changements de thermostabilité similaires à ceux de la protéine de type sauvage en présence de substrats (Fig. 5a). Ces résultats démontrent que ces mutations ont affecté des étapes importantes du mécanisme de transport, mais pas la liaison au substrat.

Quatre variantes présentaient quelques différences par rapport au type sauvage, mais pas de manière cohérente. Le variant Y89A pouvait compléter partiellement la croissance (36 ± 19%) (Fig. 2a), mais présentait des décalages plus importants que le type sauvage pour les deux nucléotides (significatifs uniquement pour l'ADP) (Fig. 5b), indiquant que ce résidu n'est pas directement impliqué dans la liaison au substrat. Le variant N123A était partiellement actif (50 ± 9%) (Fig. 2a) et les déplacements induits par le substrat n'étaient significativement différents du type sauvage qu'à 5 mM (Fig. 5b). La souche exprimant le variant V294 s'est développée sur du glycérol à des niveaux de type sauvage (84 ± 14 %) (Fig. 2a) et la protéine purifiée était plus stable (53,7 ± 0,5 °C) que le type sauvage (50,2 ± 0,6 °C) (Fig. 3a). Cela a entraîné une fausse signification à de faibles concentrations de substrat, mais il a atteint des niveaux de type sauvage à la concentration la plus élevée pour l'ATP (Fig. 5b). Enfin, la stabilité de la protéine mutante I193A était très variable (Figs. 5b, 3a), empêchant une évaluation de l'importance des déplacements induits par le substrat.

Les résidus qui ne sont pas impliqués dans la liaison au substrat étaient situés tout au long de la voie de translocation, mais également à proximité de ceux dont il a été démontré qu'ils participaient à la liaison au substrat (Fig. 5c). Ces résultats montrent que les tests de décalage de thermostabilité peuvent identifier avec précision les résidus individuels participant aux interactions protéine-substrat et que la liaison au substrat est confinée à un groupe de résidus dans la voie de translocation. Remarquablement, pour toutes les protéines testées, il n'y avait aucune différence significative entre les déplacements thermiques induits par l'ADP ou l'ATP à n'importe quelle concentration de substrat (Fig. 7 supplémentaire).

Les transporteurs mitochondriaux d'ADP/ATP ont des caractéristiques uniques qui leur permettent d'atteindre un flux élevé d'ADP et d'ATP à travers la membrane interne mitochondriale pour soutenir nos activités quotidiennes. De plus, ils ont évolué pour relever le défi d'importer de l'ADP chargé négativement contre le grand potentiel électrochimique généré à travers la membrane interne mitochondriale par la chaîne respiratoire. Bien qu'il soit étudié depuis plus de 55 ans, il reste encore de nombreuses questions ouvertes sur le mécanisme de transport, en particulier sur la liaison au substrat et son effet sur l'interconversion entre les états d'ouverture de la matrice et du cytoplasme.

De nombreuses propositions ont été faites pour l'emplacement du site de liaison au substrat19,20,24,25,26,27,28,29,30,31, mais nous abordons ici cette question expérimentalement avec les substrats pertinents. Notre approche permet une évaluation complète du processus de liaison au substrat, mettant en évidence uniquement les interactions significatives. Après avoir étudié tous les résidus de la voie de translocation entre les deux réseaux de ponts salins, nous avons identifié ceux qui jouent un rôle critique et contributif dans la liaison au substrat et avons montré qu'ils se regroupent, environ à mi-chemin le long de la voie de translocation. L'observation qu'une seule mutation peut abolir complètement la liaison indique qu'il n'y a pas d'autres sites significatifs de liaison au substrat ailleurs, tels que les boucles matricielles ou la région C-terminale, comme revendiqué précédemment24,25,26,27. Il est possible que d'autres interactions observées28,29,30,31 soient transitoires, y compris celles de "l'échelle de tyrosine"15,28, pour lesquelles nous ne trouvons aucun support expérimental. De plus, étant donné que les changements de thermostabilité induits par l'ADP et l'ATP n'étaient statistiquement différents les uns des autres à aucune concentration pour aucune des protéines testées (Fig. 7 supplémentaire), les deux substrats doivent se lier au même ensemble de résidus de manière similaire (Fig. 6). Etant donné que les transporteurs ADP/ATP fonctionnent comme des monomères14,17,46,47,48,49,50, les étapes d'importation et d'exportation doivent donc être consécutives, impliquant un mécanisme cinétique de ping-pong.

Vues latérales de la membrane de l'état cytoplasmique ouvert (à gauche) (ScAac2, PDB code 4c9h chaîne A) et de l'état ouvert à la matrice (PDB code 6gci chaîne A) (à droite) du transporteur mitochondrial ADP/ATP. Les résidus en interaction de ScAac2 sont conservés dans TtAac et pour faciliter la comparaison, nous avons utilisé le marquage TtAac (Fig. 3 supplémentaire). Les surfaces accessibles à l'eau, déterminées par HOLE59, sont représentées en bleu transparent. Les résidus de la cavité remplie d'eau qui ont des rôles critiques et importants dans la liaison au substrat sont représentés en rouge et orange, respectivement, tandis que les substrats ADP et ATP sont représentés en vert et cyan, respectivement. Les surfaces accessibles à l'eau sont représentées en bleu.

Dans le cas des résidus chargés positivement K30, R88, R197, R246 et R287, les remplacements individuels d'alanine ont entraîné la perte de fonction (Fig. 2a) et l'abolition complète des changements de thermostabilité induits par le substrat (Fig. 4a). Compte tenu de leurs propriétés chimiques, ces résidus peuvent s'engager dans des interactions ioniques avec les groupes phosphate chargés négativement des nucléotides. De cette façon, ils apportent des contributions relativement importantes à l'énergie d'interaction globale de la liaison au substrat, ce qui facilite les changements conformationnels nécessaires au transport22,23. D'autre part, le remplacement par l'alanine des résidus N85, N96, L135, V138, G192 et Y196 a entraîné une perte partielle ou totale de fonction (Fig. 2a) et des changements de thermostabilité considérablement réduits en présence de substrats (Fig. 4b). Compte tenu des propriétés chimiques et des positions relatives de ces résidus, ils sont susceptibles d'être impliqués conjointement dans la liaison de la fraction adénosine relativement hydrophobe, formant des interactions plus faibles que les résidus chargés susmentionnés, c'est-à-dire des interactions d'empilement hydrophobes et aromatiques. Ainsi, ils apporteront des contributions individuelles plus petites à l'énergie d'interaction globale de la liaison au substrat.

Des analyses de séquences antérieures, qui tenaient compte des propriétés chimiques des substrats et des contraintes de distance, ont proposé qu'il existe trois «points de contact» impliqués dans la liaison au substrat, qui sont universels pour tous les membres de la famille SLC25 et se trouvent sur les hélices transmembranaires paires18,19. Plus tard, il a été découvert qu'ils forment également des points charnières entre le noyau et les éléments de porte des domaines protéiques, reliant ainsi la liaison du substrat à un mécanisme de transport commun4,5,17. Les résidus critiques identifiés dans cette étude, R88 et R287, respectivement sur H2 et H6, correspondent aux points de contact I et III. Le résidu critique K30 sur H1 est situé entre eux à la même hauteur dans la cavité centrale. Les résidus qui contribuent de manière importante à la liaison, G192 et Y196 sur H4, sont au point de contact II, tandis que L135 et V138 sont proches. Tous ces sept résidus sont accessibles dans les deux états conformationnels et ont des conformères similaires (Fig. 6), montrant qu'ils participent conjointement à la liaison au substrat, formant le principal site de liaison au substrat tout au long des changements conformationnels. L'emplacement central de ce site est cohérent avec la formation et la perturbation de la matrice et des portes cytoplasmiques de chaque côté, lorsque le porteur passe d'un état à l'autre4,5,17. De plus, il s'est également avéré être le pivot de tous les changements conformationnels qui se produisent pendant le cycle de transport17.

Les quatre résidus restants forment deux paires asparagine/arginine, N85/R246 et N96/R197, qui sont situées sur les côtés opposés du site principal. Ils ont les mêmes propriétés chimiques et pourraient donc remplir des rôles similaires. La comparaison des structures ouvertes cytoplasmiques et matricielles montre clairement que ces paires Asn / Arg changent de conformères d'une manière dépendante de l'état (Fig. 6). A l'état cytoplasmique ouvert, les résidus N96/R197 pointent vers l'ouverture de la cavité, alors qu'ils font partie du site de liaison principal à l'état matrice ouverte. A l'inverse, les résidus N85/R246 pointent vers l'ouverture de la cavité à l'état matrice ouverte, alors qu'ils font partie du site de liaison principal à l'état cytoplasmique ouvert (Fig. 6). Puisque ces paires pointent vers l'ouverture de la cavité, elles sont susceptibles d'être responsables de la liaison initiale et de la libération finale des nucléotides.

En résumé, il existe un seul site de liaison pour le fragment adénosine et plusieurs résidus chargés positivement et polaires pour la liaison des fragments phosphate, qui s'engagent de manière dépendante ou indépendante de l'état, indiquant un processus par étapes. Leur rôle dans le cycle de transport peut être expliqué par un mécanisme par étapes, qui est notre modèle actuel des événements de liaison au substrat. Tout d'abord, l'ADP pénètre dans la cavité du support à l'état cytoplasmique par mouvement brownien et attraction électrostatique 28, 29, 30, et les fractions phosphate s'engagent avec la paire N96 / R197 (Fig. 7a). Une fois lié, le fragment adénine hydrophobe de l'ADP est libre de se lier au site de liaison hydrophobe/aromatique (G192, Y196, L135 et V138) pour la reconnaissance du substrat, le protégeant de la phase aqueuse (Fig. 7b)18,19,51. Il s'agit d'une étape importante, car les transporteurs mitochondriaux d'ADP/ATP ont une spécificité étroite, ne transportant que l'ADP, l'ATP et leurs variantes désoxy30,51. Ensuite, les fragments phosphate chargés négativement se lient aux K30, R88 et R287 chargés positivement du site de liaison principal, positionnant la molécule d'ADP dans la zone centrale et neutralisant sa charge (Fig. 7c). Tous les points de contact du site de liaison sont maintenant engagés, permettant la progression vers les étapes suivantes. Le phosphate terminal de l'ADP commence à s'engager avec la paire N85 / R246 (Fig. 7d), poursuivant les changements conformationnels vers les états occlus (Fig. 7e) et à matrice ouverte (Fig. 7f). Une pose similaire, mais pas identique, à celle de la Fig. 7d a été observée dans les simulations MD28,30, mais les temps de simulation (<1 μs) étaient trop courts pour l'achèvement du demi-cycle (~ 0, 5 ms). Enfin, le couple N85/R246 rapproche l'ADP de l'embouchure de la cavité et le libère dans la matrice mitochondriale pour la synthèse d'ATP (Fig. 7f). L'ATP nouvellement synthétisé est transporté hors de la mitochondrie par le transporteur dans une série similaire d'interactions et de changements conformationnels4,5,17, mais se produisant en sens inverse (Fig. 7g-l).

Différentes étapes du cycle de transport, a–d, l état cytoplasmique ouvert, e, k état occlus et f–j état matrice ouverte. Les substrats ADP et ATP ont un fragment adénine (vert et cyan, respectivement), un fragment ribose (jaune) et deux ou trois fragments phosphate, respectivement (orange). Le site de liaison à l'adénosine est représenté par une forme de fer à cheval, tandis que les résidus chargés positivement et polaires du site de liaison sont représentés respectivement en bleu et en vert. Les pointes de flèches noires montrent les mouvements de substrat qui induisent la conversion entre les états, tandis que les rouges indiquent l'entrée et la sortie des substrats.

De cette manière par étapes, les grandes molécules d'ADP et d'ATP conformationnellement diverses sont dirigées à travers une série de conformateurs qui accompagnent les changements conformationnels complexes nécessaires à leur translocation. De plus, la position du site central avec les deux paires Asn/Arg de part et d'autre indique que les substrats sont soumis à un ensemble similaire d'interactions indépendamment de la direction d'où ils viennent, expliquant la nature réversible du transport observée. En accord avec les observations précédentes, la direction du transport n'est pas déterminée par les propriétés des protéines, mais par les gradients chimiques des substrats et le potentiel de membrane.

De plus, les propriétés électrostatiques des résidus de liaison identifiés peuvent expliquer un aspect important de la bioénergétique du transport des nucléotides adénine dans les mitochondries. Lors de l'importation d'ADP, trois charges négatives sont déplacées contre le potentiel de membrane, tandis que lors de l'exportation d'ATP, quatre charges négatives sont déplacées avec lui. Les mouvements de charge ont été mesurés directement à l'aide de nucléotides en cage, donnant des valeurs de +0,3 ou +0,5 pour l'étape d'import ADP et de -0,7 ou -0,5 pour l'étape d'export ATP52,53. Sur la base de ces observations, il a été proposé que le site de liaison au substrat contienne 3,3 ou 3,5 contre-charges positives52,53. Ces mesures concordent bien avec les trois charges positives de K30, R88 et R287 dans le site de liaison principal, qui se réorientent avec le substrat vers l'autre compartiment, lorsque le porteur change de conformation. Les charges partielles pourraient être dues aux interactions dépendantes de l'état du R197 ou du R246, qui sont transitoires et de nature plus faible. Les charges partielles stimulent à la fois l'importation d'ADP et l'exportation d'ATP en présence d'un grand potentiel de membrane et minimisent la force électrophorétique sur les substrats liés à l'état occlus. L'échange équimolaire observé d'ADP et d'ATP n'est pas déterminé par les propriétés du site de liaison au substrat, mais par les deux réseaux de ponts salins, qui empêchent les changements conformationnels en l'absence de substrat. Seule la liaison au substrat conduira à un changement de conformation, car elle fournit un apport d'énergie pour briser le réseau22,23, et il y aura donc un pour un échange des deux substrats.

Fait intéressant, les variantes K30A, R88A et R287A étaient plus thermostables (57,3 ± 1,2, 53,1 ± 1, 64,4 ± 0,2 °C respectivement) que le porteur de type sauvage (50,2 ± 0,6 °C) (Fig. 3), en raison de la suppression de l'une des charges positives situées à proximité les unes des autres dans la cavité centrale. Ainsi, le porteur pourrait être empêché de s'interconvertir entre les états en l'absence de substrats, en raison de la barrière énergétique élevée imposée par la répulsion de ces trois charges positives lorsque le porteur change de conformation. La liaison de l'ADP et de l'ATP chargés négativement à ces résidus réduirait l'énergie libre en les neutralisant, entraînant une translocation du substrat. Les mutations G291A et V294A, qui affectent les résidus interhélicoïdaux17, peuvent entraver la dynamique, tandis que R100A, qui équivaut à une attelle de tyrosine17, peut affaiblir le réseau cytoplasmique, rendant l'état cytoplasmique ouvert stochastiquement plus probable. Ainsi, ces mutations rendent également l'interconversion des états moins favorable, conduisant à des variants plus stables (Fig. 3).

En conclusion, les propriétés du site de liaison identifié expliquent de nombreuses caractéristiques du mécanisme qui jusqu'à présent n'avaient aucune explication moléculaire. Les mêmes principes, tels que découverts ici, pourraient s'appliquer à la liaison et au transport de substrats pour d'autres membres de la famille des porteurs mitochondriaux SLC25, qui sont actuellement à l'étude.

Le sujet de l'étude était le transporteur mitochondrial ADP/ATP de Thermothelomyces thermophila. Pour l'expression du transporteur ADP/ATP mitochondrial de type sauvage, le gène a été optimisé en codons et cloné dans un vecteur dérivé pYES3/CT (Carlsbad, CA, Invitrogen, USA), contenant le promoteur pPIC2 constitutivement actif du transporteur de phosphate pic2 de Saccharomyces cerevisiae21,46. Des remplacements d'alanine simples ont été introduits dans les positions indiquées pour chaque variante en remplaçant le codon pertinent par GCT (le codon le plus fréquent pour l'alanine dans le génome de la levure), en utilisant la PCR54 par chevauchement-extension avec la polymérase KOD HotStart (Novagen). Les amorces pour introduire les mutations sont présentées dans le tableau supplémentaire 1. Les plasmides d'expression ont été transformés dans les souches de S. cerevisiae WB-12 (MATα ade2-1 trp1-1 ura3-1 can1-100 aac1::LEU2 aac2::HIS3)33, dans lesquelles les gènes aac1 et aac2 sont perturbés et dans la souche W303-1B (MATα leu2‐3, 112 trp1‐1 can1‐100 ura3‐1 ade2‐1 his3‐11,15), en utilisant la méthode LiAc/SS carrier DNA/PEG55. Les transformants réussis ont été sélectionnés sur des plaques de milieu d'abandon de tryptophane complet synthétique (Formedium), additionnées de glucose à 2 % (p/v). Un vecteur vide, généré en restaurant le site de clonage multiple du vecteur, a été utilisé comme contrôle.

La souche WB-12 exprimant les protéines de type sauvage ou mutantes ou le vecteur vide a été cultivée pendant une nuit dans un milieu de suppression de tryptophane complet synthétique additionné de glucose à 2 % (p/v). Les cellules ont été lavées trois fois avec de l'eau stérile ultra-pure, de sorte que le glucose soit complètement éliminé et dilué à une DO600 de 1. Quatre dilutions en série (1:10) ont été faites et 3,5 μL de la culture de départ et chaque dilution ont été distribuées sur une plaque YPG et incubées à 30 °C pendant 72 h. Seules les deuxième et troisième dilutions ont été utilisées pour l'analyse. Chaque plaque contenait le type sauvage et le contrôle vectoriel vide. La croissance des mutants de remplacement de type sauvage et d'alanine a été quantifiée par densitométrie. Les images numérisées ou les photographies des plaques ont été analysées à l'aide du logiciel Fiji (version 2.3.0/1.53q)56, en particulier l'outil « Gel analysis ». La densité des colonies (surface entière) a été mesurée et a été exprimée en pourcentage de la densité du type sauvage de la même plaque et dilution, après soustraction de la densité du vecteur vide des deux. Les pourcentages de croissance calculés à partir des deuxième et troisième dilutions (10-2, 10-3) ont été moyennés et cette valeur constituait une répétition biologique. Les expériences ont été répétées indépendamment quatre fois.

Pour chaque protéine de type sauvage et variante, une pré-culture de 1 L de la souche d'expression a été utilisée pour inoculer 10 L de milieu YPG plus 0,1 % (p/v) de glucose dans un Bio-bundle Applikon Autoclavable de 15 L avec contrôle eZ. La souche WB-12 ou W303-1B a été utilisée comme arrière-plan génétique pour le type sauvage, car aucune différence n'a été observée dans le rendement, la stabilité ou l'activité du support purifié à partir de l'une ou l'autre des souches. Pour les variants, la souche W303-1B a été sélectionnée, car cette souche permettait une expression suffisante, quel que soit l'état fonctionnel de la protéine mutante. Les cellules ont été lysées à l'aide d'un DYNO-MILL (Willy A. Bachofen) et les mitochondries ont été isolées57, congelées instantanément dans de l'azote liquide et stockées à -70 ° C jusqu'à leur utilisation.

Des mitochondries de levure isolées (~350 mg de protéines totales) ont été solubilisées par remise en suspension dans un tampon contenant 20 mM de Tris-HCl pH 7,5, 10 % (v/v) de glycérol, 150 mM de NaCl, 20 mM d'imidazole pH 7,5, un comprimé de cocktail d'inhibiteurs de protéase sans EDTA (Roche) et 1 % (p/v) de dodécyl-β-maltoside (Glycon Bio Chemicals GmbH) suivie d'une agitation douce à 4 °C pendant 1 h. La matière particulaire a été éliminée par ultracentrifugation (235 000 × g, 45 min, 4 ° C) et la fraction soluble a été incubée avec des billes de Sepharose de nickel préalablement lavées et équilibrées (Tris-HCl 20 mM pH 7, 5, NaCl 150 mM) (GE Healthcare) pendant 2 h, à 4 ° C, sous agitation douce. Les protéines non liées ont été éliminées par centrifugation (200 × g, 5 min, 4 °C) et la fraction liée a été placée dans une colonne vide (BioRad), où elle a été lavée avec 40 volumes de colonne de tampon A (20 mM HEPES-NaOH pH 7,5, 150 mM NaCl, 20 mM imidazole pH 7,5, 0,1 % (p/v) dodécyl-β-maltoside, 0,1 mg /mL tétraoléoyl cardiolipine), suivi de 25 volumes de colonne de tampon B (20 mM HEPES-NaOH pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 % (p/v) dodécyl-β-maltoside, 0,1 mg/mL tétraoléoyl cardiolipine). Le matériau de la colonne a ensuite été remis en suspension avec 500 μL de tampon B et additionné de 5 mM de CaCl2 et de 10 μg de protéase du facteur Xa (New England Biolabs) pour une digestion sur colonne, pendant une nuit à 10 ° C, sous agitation douce. Pour les variantes N123A, G192A, I193A, R197A et R246A, l'étape de digestion sur colonne a été réduite à 2 h, en utilisant 30 μg de protéase du facteur Xa, en raison de l'instabilité des protéines au fil du temps. Après le traitement au facteur Xa, la protéine clivée a été séparée de la résine de nickel Sepharose avec une colonne de centrifugation Proteus Midi vide (Generon) (200 × g, 5 min, 4 ° C). Les concentrations de protéines ont été mesurées avec un spectrophotomètre (NanoDrop Technologies) à 280 nm ou le kit de dosage de protéines d'acide bicinchoninique (BCA) (Thermo Fisher Scientific). Une protéine fraîchement purifiée a été utilisée pour les essais de décalage de thermostabilité CPM.

L'évaluation de la stabilité des populations de protéines pour le type sauvage et les variants en présence et en l'absence d'effecteurs (substrats ou inhibiteurs) a été réalisée via un dépliement thermique, induit par une rampe de température32. Dans ce test, les résidus de cystéine initialement inaccessibles deviennent exposés au solvant par dénaturation thermique et réagissent avec le fluorophore N‐[4‐(7‐diéthylamino‐4‐méthyl‐3‐coumarinyl)phényl]‐maléimide (CPM)40. La réaction conduit à la formation d'adduits fluorescents, qui est surveillée à l'aide d'un instrument de PCR quantitative rotative (qPCR) (Rotor gene Q, Qiagen). Pour chaque expérience, une solution mère de 5 mg/mL de CPM dans du diméthylsulfoxyde a été diluée à 0,1 mg/mL dans du tampon de purification B (20 mM HEPES – NaOH pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 % (p/v) dodécyl-β-maltoside, 0,1 mg/mL de tétraoléoyl cardiolipine) et a été équilibrée dans l'obscurité, pendant 10 min, à température ambiante. Trois microgrammes de protéine purifiée ont été mélangés avec l'effecteur pertinent (le cas échéant) et dilués dans le tampon B jusqu'à un volume final de 45 μL, auquel 5 μL de solution CPM à 0,1 mg/mL ont été ajoutés. Les effecteurs ADP et ATP ont été ajoutés à des concentrations finales de 0,1, 0,5, 1, 5 et 10 mM, CATR à 20 μM et BKA à 20 μM plus 5 μΜ d'ADP, qui a été ajouté pour permettre aux porteurs de passer d'un état à l'autre afin de se lier à l'inhibiteur21. Le mélange a été vortexé très brièvement et a été incubé dans l'obscurité, pendant 10 min, à 4 ° C, avant d'être placé dans l'instrument qPCR. Par la suite, la population protéique a été dosée dans un gradient de température de 25 à 90 °C, correspondant à une vitesse de ~4 °C par min. La fluorescence croissante émise par l'adduit protéine-fluorophore a été mesurée dans le canal HRM de la machine (excitation à 440–480 nm et émission à 505–515 nm). Les profils de dépliage ont été analysés avec le logiciel Rotor‐Gene Q 2.3, où le point d'inflexion des courbes de dépliage a été utilisé pour déterminer la température de fusion apparente (Tm) des protéines dans les différentes conditions testées. Une valeur ΔTm a été obtenue en soustrayant la Tm de la protéine en l'absence d'effecteurs de la Tm à chaque concentration des effecteurs.

Le modèle de TtAac à l'état cytoplasmique ouvert a été généré avec la version 9.2258 de Modeller, en utilisant les alignements basés sur la structure des chaînes A des codes PDB 1okc, 4c9h, 4c9q et 4c9j et les contraintes selon lesquelles les résidus 140 à 156 doivent être hélicoïdaux comme dans la structure à l'état ouvert de la matrice de TtAac, code PDB : 6gci. La notation DOPE a été utilisée pour vérifier les modèles. Le score de collision a été amélioré en minimisant l'énergie de la structure dans Chimera. Après inspection des résidus du site de liaison, K30 avait changé de position par rapport au résidu équivalent en 4c9h et a été renvoyé au conformère d'origine. Enfin, les extrémités N et C ont été tronquées pour refléter la structure en 4c9h. Les surfaces accessibles à l'eau ont été déterminées par HOLE59.

Les résultats dans toutes les figures sont présentés sous forme de moyenne ± ET du nombre d'expériences indiqué. L'analyse statistique des données a été réalisée avec GraphPad Prism version 9.2.0 (GraphPad Software, San Diego, Californie USA) comme décrit ci-dessous. Dans les expériences de complémentation, les différences de croissance ont été analysées par un test t bilatéral à un échantillon, comparant le pourcentage de croissance des variants au pourcentage de croissance moyen du type sauvage. Les différences entre les valeurs de Tm spécifiques au variant et la valeur de Tm de type sauvage ont été évaluées avec une ANOVA unidirectionnelle, suivie d'un test post hoc de Dunnett pour corriger les comparaisons multiples. Les différences entre les valeurs de Tm spécifiques du variant par rapport au Tm de type sauvage en présence d'inhibiteurs (CATR et BKA) ont été évaluées de la même manière (ANOVA à une voie, suivie d'un test post hoc de Dunnett). Concernant les déplacements thermiques induits par le substrat (ADP ou ATP) sur les variants protéiques, les différences entre les groupes ont été évaluées par une ANOVA à deux voies avec interaction pour chaque concentration de nucléotide testée. Les effets simples entre les variants protéiques au niveau du substrat ont été analysés et corrigés à l'aide du test post hoc Dunnet contre la protéine de type sauvage (visualisé sur les figures 4, 5). Les effets simples entre les substrats pour chaque niveau de protéine ont été analysés et corrigés par le test post hoc Sidak (visualisé pour 10 mM dans la Fig. 7 supplémentaire). Les différences ont été considérées comme significatives au seuil de 1 %.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données sources sont fournies avec ce document. Toutes les données de complémentation et de thermostabilité générées dans cette étude ont été déposées dans la base de données Mendeley sous le code d'accession https://doi.org/10.17632/mrhnw45w5y.1 (https://data.mendeley.com/datasets/mrhnw45w5y/1) Les données sources sont fournies avec cet article.

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Nous tenons à remercier le Dr Gonçalo C. Pereira pour ses conseils sur les analyses statistiques et le Dr Chancievan Thangaratnarajah pour la génération du vecteur dérivé pYES3/CT vide utilisé dans les études de complémentation. Ce travail a été soutenu par le Medical Research Council Grant MC_UU_00028/2 à ERSK.

Unité de biologie mitochondriale du Conseil de la recherche médicale, Université de Cambridge, Cambridge Biomedical Campus, Keith Peters Building, Hills Road, Cambridge, CB2 0XY, Royaume-Uni

Vasiliki Mavridou, Martin S. King, Sotiria Tavoulari, Jonathan J. Ruprecht, Shane M. Palmer et Edmund RS Kunji

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VM, MSK, ST et ERSK ont conçu la recherche, SMP a effectué les fermentations à grande échelle, VM et MSK ont effectué la biologie moléculaire et les préparations mitochondriales, VM a purifié les protéines et effectué une analyse biophysique, VM et ERSK ont analysé les données, VM, JJR et ERSK ont préparé les figures, VM, MSK, ST, JJR et ERSK ont rédigé l'article

Correspondance à Edmund RS Kunji.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie le(s) relecteur(s) anonyme(s) pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail.

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Réimpressions et autorisations

Mavridou, V., King, MS, Tavoulari, S. et al. La liaison au substrat dans le transporteur mitochondrial ADP/ATP est un processus par étapes guidant les changements structurels dans le cycle de transport. Nat Commun 13, 3585 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-31366-5

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Reçu : 20 décembre 2021

Accepté : 14 juin 2022

Publié: 23 juin 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-31366-5

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