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Aug 09, 2023

Sur l'interaction entre les lipides et la dynamique asymétrique d'un transporteur ABC dégénéré NBS

Volume Biologie des communications

Communications Biology volume 6, Article number: 149 (2023) Citer cet article

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Les protéines associées à la multirésistance aux médicaments sont des exportatrices de la famille ABC C. Ils sont cruciaux en pharmacologie car ils transportent divers substrats à travers les membranes. Cependant, le rôle du site dégénéré de liaison aux nucléotides (NBS) reste incertain, tout comme l'interaction avec l'environnement lipidique environnant. Ici, nous proposons un aperçu dynamique et structurel de MRP1 d'env. Simulations de dynamique moléculaire 110 μs. La liaison de l'ATP à NBS1 est probablement maintenue tout au long de plusieurs cycles de transport. Le comportement asymétrique de NBD est assuré par une transduction de signal plus faible de NBD1 vers le reste de la protéine en raison de l'absence de conformation boule et douille entre NBD1 et les hélices de couplage. Même si les lipides environnants jouent un rôle actif dans la communication allostérique entre la poche de liaison au substrat et les NBD, nos résultats suggèrent que la composition lipidique a un impact limité, principalement en affectant la cinétique de transport. Nous pensons que notre travail peut être étendu à d'autres protéines NBS ABC dégénérées et fournir des indications pour déchiffrer les différences mécanistes entre les transporteurs ABC.

Les transporteurs de cassettes de liaison à l'ATP (ABC) appartiennent à l'une des plus grandes superfamilles de protéines trans-royaumes. La résolution structurelle de plusieurs transporteurs ABC a conduit à différentes conformations (à savoir, tournées vers l'intérieur - IF, tournées vers l'extérieur - OF et occluses), qui illustrent l'accès alterné comme le modèle le plus susceptible de rationaliser la translocation du substrat le long du cycle de transport1,2,3. Les structures de transport ABC sont constituées d'au moins deux domaines transmembranaires (TMD) constitués de six hélices transmembranaires (TMH). Les TMD sont liés à deux domaines de liaison aux nucléotides (NBD) qui sont conservés de manière évolutive sur les espèces. Le cycle de transport ABC nécessite la liaison de deux molécules d'ATP et l'énergie libérée par l'hydrolyse d'au moins l'une d'entre elles3,4,5,6,7. Les molécules d'ATP se lient à l'interface du dimère NBD qui adopte un arrangement tête-bêche pseudo-symétrique non covalent ; permettant la formation de deux sites de liaison aux nucléotides (NBS). Les deux NBS sont formés par les motifs Walker A et B conservés, les boucles A, Q et H d'un NBD et la séquence de signature ABC et la boucle X de l'autre NBD4,5,7,8.

À l'exception de quelques membres (c.-à-d. CFTR, ABCA4, ABCD4, SUR1/2)2,3,9,10, les transporteurs ABC eucaryotes sont des exportateurs, c'est-à-dire qu'ils extrudent des substrats vers le compartiment extracellulaire. Les transporteurs ABC eucaryotes étaient autrefois classés en familles de type I (ABCB, ABCC, ABCD) et de type II (ABCA, ABCG). Récemment, les diversités structurelles et fonctionnelles des transporteurs ABC ont conduit à une nouvelle classification basée sur le pliage2,3 dans laquelle les exportateurs précédents de type I et de type II adoptent respectivement le pliage de type IV et V.

Les protéines associées à la résistance multidrogue (MRP) sont des transporteurs ABC dégénérés NBS3,4,5,7,8. Dans le NBS1 non canonique, le glutamate catalytique Walker B, la tyrosine à boucle A et le premier résidu glycine du motif de signature ABC sont mutés en résidus aspartate, tryptophane et valine, respectivement. Ces mutations étaient associées à une activité ATPase significativement plus faible et à une affinité de liaison à l'ATP plus élevée pour le NBS14,7 dégénéré. Ces observations ont récemment conduit au développement d'un nouveau modèle asymétrique pour la fonction NBD qui peut affecter la dynamique et la fonction de l'ensemble du transporteur3,7. La fonction et la cinétique de l'ABCC1/MRP1 bovin (bMRP1) ont été étudiées de manière approfondie et approfondie en combinant des informations structurelles provenant d'expériences de cryo-microscopie électronique (cryo-EM) et d'une seule molécule Förster Resonance Energy Transfer (smFRET)5. Malgré les informations solides fournies par la résolution de la structure bMRP1, des différences inexpliquées entre les exportateurs ABCB et ABCC ont été observées, en partie en raison de l'environnement à base de détergent non natif utilisé pour les expériences bMRP17,11.

Les transporteurs ABC jouent un rôle crucial en pharmacologie en transportant une grande variété de substrats, y compris des xénobiotiques et des composés endogènes, à travers les membranes cellulaires. Par exemple, leur rôle pharmacologique a été souligné par l'International Transporter Consortium (ITC) qui dresse une liste de transporteurs "d'importance clinique émergente" pour lesquels des interactions avec de nouveaux xénobiotiques doivent être étudiées dans le développement de médicaments12. Au cours des dernières décennies, les transporteurs ABCC, dans lesquels les MRP sont inclus, ont suscité un intérêt croissant en raison de leur rôle en pharmacologie, y compris les réponses interindividuelles des patients aux traitements. Par exemple, des investigations sur ABCC2/MRP2 et ABCC4/MRP4 ont été recommandées par l'ITC pour fournir rétrospectivement une explication mécaniste des observations cliniques concernant l'élimination des médicaments13. Compte tenu du rôle des MRP dans les relations pharmacocinétiques et pharmacodynamiques locales (PK/PD) et donc dans la biodisponibilité locale des médicaments14, il est toujours nécessaire de déchiffrer le cycle de transport MRP in situ pour fournir un aperçu complet des événements de traversée membranaire xénobiotique. Ceci est particulièrement pertinent pour les MRP situées dans les cellules rénales tubulaires proximales et les hépatocytes hépatiques puisque les reins et le foie sont impliqués dans l'élimination de la plupart des xénobiotiques utilisés dans le monde15.

Malheureusement, il n'existe pas encore de structure expérimentalement résolue pour les MRP humains. Une structure MRP4 de filetage de protéine raffinée par MD16 a été proposée pour laquelle la résolution de calcul exclut les investigations fonctionnelles ou la dynamique structurelle approfondie. Cependant, plusieurs conformations du transporteur bMRP1 ont été résolues par cryo-EM4,5,8. Compte tenu de la grande similitude de séquence avec l'orthologue humain hMRP1 (91 %) ainsi qu'avec d'autres MRP humaines (environ 40 à 50 %), l'utilisation de structures bMRP1 comme prototype semble pertinente pour étudier la dynamique et les fonctions des transporteurs MRP3. L'exportateur MRP1 adopte le pliage de type IV ; cependant, il possède un TMD N-terminal supplémentaire composé de cinq TMH. Il a été démontré que le soi-disant TMD0 ne jouait aucun rôle dans l'activité de l'ABC ATPase ou dans le transport du substrat3,4,8. Par conséquent, un modèle MRP1 sans TMD0 peut être utilisé comme prototype pour les exportateurs ABCC même pour ceux qui ne possèdent pas ce domaine (par exemple, MRP4). TMD0 est connecté aux TMD ABC conventionnels par un lieur (L0) qui s'est avéré obligatoire à la fois pour le trafic et la fonction8,17. La séquence L0 est conservée chez tous les membres de la sous-famille ABCC même en l'absence de TMD08. Il est important de noter que puisque le présent modèle n'inclut pas TMD0, l'étiquetage TMH standard pour ABC de type IV sera utilisé dans le présent manuscrit, c'est-à-dire TMH1 à TMH12.

Le présent travail vise à cartographier l'espace conformationnel ABC1,18 de MRP1 en considérant différents états liés (à savoir, les états liés à l'apo, à l'ATP et/ou aux leucotriènes C4—LTX—8 pour la conformation IF et l'état lié à l'ATP4 pour la conformation OF) soulignant l'importance de l'asymétrie dans les domaines ABC. De plus, compte tenu de l'importance des lipides environnants dans le cycle de transport ABCC11,19, l'interaction entre la bicouche lipidique et la dynamique des protéines a également été étudiée. Ceci a été réalisé en utilisant différents modèles informatiques de membranes symétriques constitués de (i) POPC pur (1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine), (ii) POPE pur (1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine), (iii) POPC:POPE (3:1), (iv) POPC:Chol (3:1) et (v) POPC:POPE:Chol (2:1: 1); le dernier étant le plus proche de mimer la dynamique MRP1 in situ. Des simulations de dynamique moléculaire (MD) à l'échelle de la microseconde sans biais pour tous les atomes ont été menées pour atteindre les objectifs.

Pour examiner l'espace conformationnel échantillonné lors des simulations dans POPC:POPE:Chol (2:1:1) représentant les états liés de bMRP1, différents descripteurs structurels ont été considérés selon des études antérieures1,11,18. À savoir, les angles intracellulaires (IC) et extracellulaires (EC) ont été surveillés pour les TMD, tandis que la distance NBD et l'angle de torsion du NBD ont été utilisés pour les NBD (Fig. 1 et Fig. 1 à 6 supplémentaires); ce dernier étant connu pour s'adapter le long de la transition OF-à-IF dans ABCB1/P-gp18. Ces descripteurs structurels ont également été mesurés sur un vaste ensemble de données de protéines ABC résolues expérimentalement, y compris les structures bMRP1 cryo-EM4,5,8 afin de reconstruire l'espace conformationnel ABC1,18 (Fig. 1d et tableau supplémentaire 1). Les conformations ABC connues ont été efficacement mises en évidence, c'est-à-dire IF ouvert et occlus, OF ainsi que les conformations asymétriques récemment résolues de retournement de déverrouillage (UR)1. Les simulations bMRP1 MD ont révélé la fermeture spontanée de la cavité intracellulaire pour tous les systèmes IF, quels que soient l'état lié et la composition de la membrane (Fig. 1a, b, Fig. 1 à 6 supplémentaires et Tableaux supplémentaires 2 à 5). Les distances moyennes NBD et les angles IC étaient significativement plus petits que ceux calculés pour les structures bMRP1 cryo-EM. Par exemple, les conformations IF ont convergé vers des valeurs similaires d'angle IC et de distance NBD allant de 26, 0 ± 0, 5 à 35, 4 ± 1, 8 ° et de 30, 3 ± 1, 9 à 55, 0 ± 2, 8 Å, respectivement (Fig. 1b, Fig. 1 supplémentaire, 3–4 et tableaux supplémentaires 3–4). Fait intéressant, la dimérisation spontanée des NBD a également été observée en l'absence de molécules d'ATP. La différence entre les simulations et la structure cryo-EM pourrait s'expliquer en partie par l'utilisation de détergent non natif dans les expériences7,11. En effet, les structures cryo-EM résolues de bMRP1 présentaient des angles IC et des distances NBD plus grands que les autres structures ABC résolues dans des environnements natifs (Fig. 1d). Du côté extracellulaire de la membrane bicouche lipidique, les simulations MD de OF bMRP1-(ATP)2 affichent des ouvertures mineures de la porte EC par rapport aux structures bMRP1 OF cryo-EM, suggérant l'existence d'un état légèrement plus ouvert. Cependant, les angles EC calculés sont restés faibles (inférieurs à 20 ° dans POPC: POPE: Chol (2: 1: 1), voir Fig. 1a et Fig. 1–2 supplémentaires et Tableau supplémentaire 2), ce qui empêche la rentrée du substrat1.

Conformations tournées vers l'intérieur : état apo (IF apo bMRP1), lié au substrat (bMRP1-LTX), lié à l'ATP (bMRP1-(ATP)2), lié à l'ATP/au substrat (bMRP1-LTX-(ATP)2) ; Conformation tournée vers l'extérieur : liée à l'ATP (OF bMRP1-(ATP)2). a Des instantanés représentatifs des différents systèmes bMRP1 étudiés ici au début et à la fin des simulations MD. b Evolution temporelle des angles IC et EC respectivement pour les structures IF et OF. Les angles IC et EC ont été calculés selon les paramètres structuraux ABC proposés définis dans la section Méthodes1,11,18. c Évolution dans le temps des distances NBS clés définies par les distances inter-NBD entre les résidus de glycine de Walker A et de sérine de signature ABC8. d Projection des paramètres structurels bMRP1 sur l'espace conformationnel ABC obtenu à partir de plusieurs structures ABC résolues. Les résultats ont été obtenus à partir de n = 3 trajectoires MD pour chaque système et pour lesquelles les écarts-types sont indiqués. Les identifiants PDB des structures cryo-EM bMRP1 résolues sont explicitement mentionnés. Les premier et deuxième TMD sont respectivement représentés en orange et bleu, et NBD1 et NBD2 sont respectivement colorés en jaune et cyan.

Même si les trajectoires effectuées avec l'état de pré-translocation (c'est-à-dire bMRP1-LTX-(ATP)2) ont tendance à peupler le sous-espace conformationnel ABC de la conformation OF (Fig. 1d), la translocation du substrat n'a pas été observée. Les valeurs de torsion NBD calculées pour l'état bMRP1-LTX-(ATP)2 sont similaires aux conformations OF ABC. Cependant, les distances NBD restent plus grandes que pour les structures OF ABC résolues sans substrat et les simulations OF bMRP1-(ATP)2. Les distances entre les atomes Cα de la sérine du motif de signature ABC et une glycine Walker A ont été surveillées (c'est-à-dire Gly681-Ser1430 et Ser769-Gly1329, respectivement désignés par \({d}_{{GS}}^{{NBS}1}\) et \({d}_{{GS}}^{{NBS}2}\), Fig. 1c, Fig. 7–8 supplémentaires). Les différences structurelles entre les états pré- et post-translocation (c'est-à-dire bMRP1-LTX-(ATP)2 et OF bMRP1-(ATP)2, respectivement) suggèrent qu'une transition conformationnelle du dimère NBD est nécessaire avant l'événement de translocation du substrat. Une telle transition des conformations de dimères NBD dites "non compétentes" à "compétentes" est susceptible de déclencher des transitions conformationnelles TMD suggérant qu'elle pourrait être l'étape limitante pour la transition IF vers OF.

Les conformations bMRP1 peuvent également être documentées sur la base de l'ouverture des pores TM (Figs. 9 à 13 supplémentaires). Comme prévu, le pore TM est plus grand pour OF bMRP1-(ATP)2 dans le feuillet supérieur (à z = 18 et 5 Å au-dessus du centre de la bicouche lipidique, Figs. 10–11 supplémentaires) tandis que les conformations IF restent fermées. Fait intéressant, une forme de goulot d'étranglement a été observée pour la conformation IF à 5 Å. Malgré la variabilité dynamique observée pour les profils de rayon TM dans le feuillet inférieur, la séquence suivante en termes d'ouverture a été observée (Figs. 12–13 supplémentaires) : IF apo bMRP1 > IF bMRP1-(ATP)2 > IF bMRP1-(LTX) ≈ IF bMRP1-LTX-(ATP)2 > OF bMRP1-(ATP)2. Ceci est conforme au rôle du substrat qui s'est avéré lier les faisceaux de TM dans les transporteurs ABC18, y compris bMRP14,5. Contrairement à l'angle IC et à la distance NBD qui ont tendance à diminuer rapidement au stade précoce des simulations MD, les rayons des pores TM à des profondeurs sélectionnées dans la bicouche lipidique restent relativement constants tout au long des simulations.

Les flexibilités globales ont été évaluées en calculant les fluctuations quadratiques moyennes (RMSF, Fig. 14 supplémentaire). La RMSF par résidu confirme le comportement asymétrique des NBD7, NBD2 étant plus flexible que NBD1. Pour chaque système, des analyses en composantes principales (ACP) basées sur le squelette ont été effectuées. Seules les trois premières composantes principales les plus importantes ont été considérées, révélant 85,6 % à 95,9 % des variabilités structurelles globales selon le système (Fig. 15 supplémentaire). Pour toutes les simulations IF, les trois premières plus grandes variabilités ont été systématiquement attribuées aux mouvements NBD asymétriques pour lesquels NBD2 a le plus contribué, de 27,0 à 59,6% du mouvement (Fig. 16 supplémentaire). Les premiers composants principaux ont été principalement attribués aux mouvements de torsion et de basculement NBD (films supplémentaires 1 à 5). Ceci est en accord avec la plus grande flexibilité suggérée expérimentalement des NBD à partir d'expériences smFRET le long du cycle cinétique de MRP15. En ce qui concerne les simulations OF, les deux premières composantes principales étaient associées à un mouvement de torsion NBD concerté et à l'ouverture du côté extracellulaire médiée principalement par TMH4, TMH5, TMH7 et TMH8. Il a été suggéré que ces TMH se comportent comme un seul faisceau dans ABCB1/P-gp18. De plus, dans une moindre mesure que pour les conformations IF, NBD2 est resté plus impliqué dans ce mouvement partagé que NBD1.

Le comportement asymétrique a également été illustré par l'arrangement supramoléculaire entre NBD1 et NBD2 pour lequel deux sous-populations principales ont été observées pour les états apo, bMRP1-(ATP)2 et bMRP1-LTX (Fig. 2a). Fait intéressant, les interactions au sein des NBS à travers les NBD ont été maintenues tout au long de nos simulations MD, même en l'absence de molécules d'ATP. Deux conformations NBD ont été observées, soit des arrangements de dimères NBD asymétriquement ouverts ou fermés, en faveur de ce dernier. Étonnamment, les deux arrangements ont également été observés, mais dans une moindre mesure, dans bMRP1-(ATP)2, même si les molécules d'ATP devaient maintenir les interactions à l'interface du dimère NBD. En présence de molécules de substrat et d'ATP, seule la population fermée a été observée, illustrant la transduction d'informations de la poche de liaison au substrat TMD vers les NBD afin de réduire probablement la barrière énergétique pour la transition IF à OF dans les transporteurs ABC repliables de type IV.

a Des instantanés représentatifs illustrant les conformations ouvertes et fermées des dimères NBD observés lors des simulations MD. IF apo bMRP1, bMRP1-(ATP)2 et bMRP1-LTX ont révélé deux sous-populations principales pour lesquelles les flèches noires mettent en évidence le mouvement ; tandis que les conformations pré- et post-translocation (à savoir, bMRP1-LTX-(ATP)2 et OF bMRP1-(ATP)2) ne présentaient que la conformation fermée du dimère NBD. NBD1, NBD2 et les hélices de couplage sont respectivement représentées en jaune, cyan et rose. b Paysages conformationnels locaux dépendants du système obtenus à partir de l'approche basée sur GMM développée dans la méthode InfleCS23,64 mettant en évidence l'influence des nucléotides et du substrat sur la dynamique structurale de bMRP1. c Potentiels moyens de Coulomb et de van der Waals calculés entre les nucléotides et NBS1 et NBS2, séparément (800 points ont été utilisés pour chaque réplique, traités indépendamment ; les barres d'erreur indiquent les écarts-types). d Réseaux de liaisons H calculés entre ATP et NBS1 ou NBS2 et entre LTX et les résidus de poche de liaison au substrat (les fractions de liaisons H ont été calculées à partir de chaque réplique indépendamment et ont ensuite été moyennées n = 3; barres d'erreur montrant l'écart type sur eux).

Afin d'expliquer le comportement asymétrique des NBD, une attention particulière a été portée aux hélices de couplage (CH) qui assurent la transduction du signal des TMD vers les NBD20,21. Nativement, les transporteurs ABC présentent quatre hélices de couplage reliant les domaines intracellulaires de TMH2/TMH3, TMH4/TMH5, TMH8/TMH9 et TMH10/TMH11. Les soi-disant CH2-3 et CH10-11 sont en contact avec NBD1 tandis que CH4-5 et CH8-9 interagissent avec NBD2 (Fig. 2a). Les contacts entre les CH et les NBD ne sont pas modifiés lors de la liaison des molécules d'ATP ou du substrat (Fig. 17 supplémentaire). De manière intéressante, pour un NBD donné, on peut considérer un "CH faible" (à savoir, CH2-3 et CH8-9 pour NBD1 et NBD2, respectivement) pour lequel seuls quelques contacts ont été observés. En revanche, les dits « CH forts » (à savoir, CH10-11 et CH4-5 pour NBD1 et NBD2, respectivement) présentaient plus de contact avec le NBD et pour lesquels la disposition en « boule et douille » est significativement plus prononcée que pour les « CH faibles ». Fait intéressant, dans le MRP1 de mammifère, la séquence NBD1 présente une délétion de 13 acides aminés qui est associée à moins de contacts et à des interactions significativement plus faibles entre CH2-3 et CH10-11 par rapport à CH4-5 et CH8-9 pour NBD2 (Fig. 18 supplémentaire). De plus, les quelques contacts observés entre CH2-3 et CH10-11 sont légèrement diminués en présence de molécules d'ATP alors que le schéma de contact pour NBD2, c'est-à-dire CH4-5 et CH8-9, est bien conservé quelle que soit la présence d'ATP et/ou de leucotriène C4. Cela conduit à la perturbation des arrangements dits "ball-and-socket" de CH2-3 et CH10-11 dans NBD1 qui devrait (i) être responsable de l'ouverture asymétrique NBD susmentionnée et (ii) empêcher la transduction d'informations entre les TMD et NBD18.

Les conformations IF présentaient des interactions dimères NBD plus faibles que la conformation OF, expliquant la plus grande flexibilité globale. De même, les simulations MD ont révélé une flexibilité légèrement supérieure de l'état IF apo par rapport aux systèmes liés à l'ATP et / ou à la LTX. Ceci est en accord avec des observations antérieures suggérant que les interactions entre TMH ou entre NBD sont modulées par la présence de substrat et/ou de molécules d'ATP4,7,8,22. Profitant de nos vastes simulations MD impartiales, les sous-espaces conformationnels explorés ont été présentés en termes d'énergie libre à l'aide des méthodes de regroupement InfleCS23 (Fig. 2b). Compte tenu des conformations de dimères NBD non compétentes susmentionnées, l'accent a été mis sur les paramètres structurels NBD, à savoir la torsion NBD et la distance NBD. Des variabilités plus importantes pour les conformations IF ont été observées, conduisant à de multiples minima plausibles pour lesquels l'interconversion est possible mais lente. Le sous-espace de torsion NBD par rapport à la distance NBD censé être compétent a tendance à être peuplé en présence de molécule d'ATP et / ou de substrat. Une telle découverte met en évidence le rôle central des événements de liaison à l'ATP et au substrat dans le cycle de transport ABCC1. Pour mieux déchiffrer la dynamique des dimères NBD, des réseaux structuraux24 ont été obtenus en considérant à la fois des cartes de contact (Fig. 19 supplémentaire) et des matrices de corrélation croisée dynamiques (Fig. 20 supplémentaire). Chaque NBD peut être globalement divisé en deux sous-domaines, indépendamment de la conformation ou des états liés entraînés par la liaison à l'ATP (Fig. 21 supplémentaire). En effet, des soi-disant communautés similaires étaient relativement bien conservées sur les répliques et les systèmes étudiés (tableau supplémentaire 6). La première communauté est définie par Walker A et B ainsi que par les boucles A et H. D'autre part, la deuxième communauté comprend les boucles Q et X et la séquence de signature ABC. Les résidus impliqués dans ces communautés sont fortement corrélés, ce qui suggère que le déplacement local des résidus lors de la liaison à l'ATP se propagera. Les deux communautés peuvent être considérées comme presque indépendantes ; ainsi, la liaison d'un ATP ne devrait pas avoir un impact important sur les mouvements de la seconde communauté. Pendant ce temps, étant donné l'arrangement asymétrique des dimères NBD, l'ATP et le magnésium devraient relier les communautés à travers les NBD. Fait intéressant, les corrélations dynamiques dans les simulations IF apo présentaient des variabilités plus importantes puisque les communautés pouvaient être divisées en sous-communautés (tableau supplémentaire 7), de sorte que la liaison à l'ATP devrait renforcer la coopération structurelle au sein et entre les NBD.

Une attention particulière a été portée aux modes de liaison des ATP en évaluant les potentiels de van der Waals et de Coulomb ainsi que les réseaux de liaisons H dans les NBS (Fig. 2c, d). De telles analyses ne doivent pas être considérées quantitativement du fait de la compensation des erreurs entre les deux potentiels, surtout à courte distance25. Cependant, ils peuvent être utilisés pour fournir des indications qualitatives afin de comparer les forces motrices de liaison à l'ATP. Fait intéressant, les interactions coulombiennes et dispersives ont montré des énergies moins attractives pour toutes les conformations IF que OF. Étant donné que les NBD présentent une flexibilité plus faible dans la conformation OF, les interactions ultérieures plus étroites avec les dimères NBD peuvent être rationalisées par la disposition locale appropriée des molécules d'ATP dans les NBS. Par exemple, les distances d'empilement π inférieures calculées entre les molécules d'ATP et les motifs conservés NBS étaient systématiquement plus grandes dans les conformations IF que dans les conformations OF, ce qui entraînait des énergies d'interaction plus faibles entre les molécules d'ATP et les résidus MRP1 (Fig. 2c et Tableau supplémentaire 8). Étonnamment, dans les conformations IF, NBS1 a tendance à présenter des interactions dispersives plus faibles entre la molécule d'ATP et le résidu de boucle A Trp653 par rapport à Tyr1301 dans la boucle A NBS2, tandis que la surface aromatique spatiale du tryptophane est plus grande que pour la tyrosine. D'autre part, dans la conformation OF, les contributions dispersives ont tendance à être légèrement plus importantes pour NBS1 que pour NBS2. Les réseaux de liaisons H entre les molécules d'ATP et les NBS (Fig. 2d) suggèrent un réseau similaire entre les NBS pour les conformations IF. Le réseau de liaisons H est conservé sur les conformations IF et OF concernant les interactions avec Walker A ; cependant, les systèmes IF liés à l'ATP ne présentent pas le réseau de liaisons H attendu avec le motif de signature observé dans les simulations OF. Fait intéressant, les simulations MD suggèrent un comportement asymétrique entre NBS en ce qui concerne les liaisons H avec les résidus de glutamine en boucle Q, à savoir Gln713 et Gln1374, respectivement pour NBS1 et NBS2. Les distances calculées suggèrent que la liaison de l'ATP γ-phosphate à la boucle Q de NBS1 était plus faible que pour NBS2 dans la conformation OF. Le comportement opposé a été observé dans les simulations MD pour les conformations IF. Par conséquent, les simulations actuelles soulignent que les modes de liaison à l'ATP appropriés dans les deux NBS sont essentiels pour déclencher les changements conformationnels nécessaires à la translocation du substrat.

Une attention particulière a été accordée à la poche de liaison au substrat et elle a été comparée à la structure cryo-EM de bMRP1 liée au leucotriène C48. En accord avec les expériences, le mode de liaison des leucotriènes C4 a eu lieu dans les deux poches dites P et H ("P" et "H" signifiant respectivement polaire et hydrophobe). Compte tenu de la caractéristique amphiphile du leucotriène C4, les réseaux de Coulomb et de liaisons H se sont avérés essentiels pour la liaison au substrat8. Les simulations MD ont mis en évidence les mêmes résidus clés qui ont été observés expérimentalement (Fig. 2d). Par exemple, de forts ponts salins ont été observés entre les résidus d'arginine (Arg1248, Arg1196 et Arg593, figures 2d et 3a) maintenant au moins deux des trois groupes carboxylate de leucotriène dans la poche P. Fait intéressant, les variabilités en termes de fractions de liaisons H ou d'énergies d'interaction (Fig. 2d et Fig. 22 supplémentaire) suggèrent un mode de liaison dynamique en accord avec sa rupture attendue le long des changements conformationnels à grande échelle IF à OF.

une poche de liaison au substrat met en évidence les résidus importants de la liaison des leucotriènes C4. La structure des leucotriènes est également montrée pour laquelle les caractéristiques amphiphiles sont soulignées. b Définition de la voie allostérique étudiée dans la présente étude pour laquelle NBS1 et NBS2 ont été traités séparément. c Efficacités allostériques calculées du flux d'informations entre la poche de liaison au substrat et NBS1 (rouge) ou NBS2 (bleu) pour les différents systèmes intégrés dans POPC:POPE:Chol (2:1:1). Les lignes pleines, en pointillés et en pointillés représentent respectivement les efficacités en considérant : Protéine + lipides + nucléotides/substrat, Protéine + nucléotides/substrat et Protéine autonome. Les erreurs standard sont présentées sous forme de nuances et ont été calculées à partir de n = 3 répliques traitées indépendamment pour chaque système. d Les contributions des protéines et des lipides e au flux d'informations pour la communication allostérique de la poche de liaison au substrat vers NBS1 et NBS2 montrent que NBD2 et ses hélices de couplage (CH4-5 et CH8-9) sont systématiquement impliquées quelle que soit la région du puits.

Même si les différences en termes d'énergies d'interaction et de réseaux de liaisons H entre bMRP1-LTX-(ATP)2 et bMRP1-LTX ou bMRP1-(ATP)2 sont restées faibles, elles suggèrent un effet distant entre les NBS et la poche de liaison au substrat. L'effet allostérique a été évalué entre la poche de liaison au substrat et NBS1 et NBS2, indépendamment (Fig. 3b). Ceci a été réalisé en considérant les résidus clés pour chaque site de liaison (tableau supplémentaire 9) pour les analyses de réseau de voies allostériques26,27. Les efficacités (Fig. 3c) ont été calculées en présence ou en l'absence de substrat et de molécules d'ATP. L'impact de la bicouche lipidique POPC:POPE:Chol (2:1:1) a également été pris en compte. Nativement, la poche de liaison au substrat et les NBS sont connectés de manière allostérique à travers la protéine, comme le montrent les efficacités calculées sans inclure de nucléotides ou de substrats. Comme prévu, la présence de molécules de substrat et/ou d'ATP a considérablement augmenté la communication allostérique de la poche de liaison au substrat aux deux NBS. Fait intéressant, malgré la dynamique asymétrique NBD susmentionnée, les calculs actuels n'ont pas montré de différence significative en termes d'efficacité entre les NBS. Les valeurs intermédiaires ont été calculées pour représenter les contributions des résidus et des domaines à la voie allostérique (Fig. 3d et Fig. 23 à 25 supplémentaires). Une attention particulière a été accordée aux systèmes liés à l'ATP, c'est-à-dire IF bMRP1-(ATP)2 et bMRP1-LTX-(ATP)2 ainsi que OF bMRP1-(ATP)2 (Fig. 4d), d'autres systèmes sont rapportés dans la Fig. 26 supplémentaire. Les principaux résidus impliqués dans les voies allostériques de poche de liaison-NBS sont principalement situés dans la partie intracellulaire des TMH. De manière intéressante, un comportement asymétrique, pour lequel TMH4, TMH5, TMH7 et TMH8 sont significativement plus impliqués que TMH1, TMH2, TMH10 et TMH11, a de nouveau été observé. bMRP1 présente une caractéristique asymétrique concernant les arrangements dits "ball-and-socket" qui s'est avéré être responsable de la coopération structurelle entre les TMH et les NBD par le biais d'hélices de couplage8. La suppression de treize acides aminés dans NBD1 conduit à une coopération plus faible entre TMH1, TMH2, TMH10 et TMH11 avec NBD1, ce qui diminue à son tour la communication allostérique entre la poche de liaison au substrat et NBS1. De plus, nos calculs suggèrent que l'information passe majoritairement par NBD2 puisque la communication directe avec NBD1 est significativement affaiblie par l'absence de conformation "ball-and-socket" pour CH10-118. Fait intéressant, il a également été démontré que la bicouche lipidique POPC: POPE: Chol jouait un rôle clé dans la communication allostérique entre la poche de liaison au substrat et les NBS (Fig. 3c). Cependant, même si son impact est significatif, les contributions de la bicouche lipidique semblaient plus douces que dans, par exemple, les transporteurs membranaires de la superfamille des facilitateurs majeurs28.

a Angle IC moyen, angle EC et distance NBD pour tous les systèmes bMRP1 intégrés dans différentes bicouches lipidiques calculées à partir de n = 3 trajectoires MD par état et bicouche lipidique. La barre d'erreur fait référence aux écarts-types de chaque ensemble de données. b Paramètres calculés de l'ordre de la queue des lipides de l'atome C (SCD) pour les queues palmitique (sn1) et oléique (sn2) pour tous les systèmes intégrés dans les modèles basés sur POPC. Les lignes pleines, en pointillés et en pointillés représentent respectivement les paramètres d'ordre lipidique obtenus dans les modèles de bicouche lipidique POPC: POPE: Chol (2: 1: 1), POPC: Chol (3: 1) et POPC. La barre d'erreur fait référence aux écarts-types de chaque ensemble de données calculé. c Déformations calculées de l'énergie libre de la membrane30 obtenues en faisant la moyenne sur n = 3 trajectoires MD, en considérant chaque réplique indépendamment. Les données brutes sont disponibles dans les tableaux supplémentaires 10 à 12. Les barres d'erreur font référence à l'écart type sur les trois répliques indépendantes. d Points chauds de liaison calculés obtenus à partir du cholestérol et des lipides PE définis par une probabilité de présence supérieure à 80 et 50 % respectivement pour le cholestérol et les lipides PE. Un zoom sur le cholestérol résolu Cryo-EM (violet) est montré pour mettre en évidence l'orientation parallèle spécifique par rapport à la bicouche lipidique. e Zones lipidiques importantes basées sur l'analyse des voies allostériques. L'emplacement des principales molécules de cholestérol impliquées dans la communication allostérique entre la poche de liaison au substrat et les NBS est indiqué. Les deux NBS sont considérés, mettant en évidence les rôles centraux attendus des régions L0, pré-TMH1 et pré-TMH7 dans des interactions lipides-protéines spécifiques qui pourraient favoriser la fonction de bMRP1.

Comme de nos jours, une plus grande attention a été accordée à l'interaction entre l'environnement lipidique environnant11,19,22,26,28 et les protéines membranaires, la dynamique des protéines dépendantes des lipides et les interactions lipides-protéines ont été étudiées. Ceci a été réalisé en effectuant des simulations MD dans différentes bicouches lipidiques, à savoir POPC, POPC:Chol (3:1), POPC:POPE:Chol (2:1:1). Les systèmes IF apo bMRP1 et OF bMRP1-(ATP)2 ont également été pris en compte dans les bicouches lipidiques POPE et POPC: POPE (3: 1) irréalistes.

La projection de paramètres structurels dépendant des lipides sur l'espace conformationnel ABC (Figs. 1, 27 et 28 supplémentaires) a révélé que la plupart des simulations actuelles ont tendance à explorer des sous-espaces ABC similaires, quelle que soit la composition de la membrane bicouche lipidique. La figure 4a compare les moyennes des paramètres structurels en fonction des compositions de la bicouche lipidique pour toutes les simulations MD réalisées dans la présente étude. Pour les conformations IF, seuls les paramètres structurels intracellulaires (c'est-à-dire l'angle IC et la distance NBD) présentaient de légers écarts en fonction de la composition lipidique. Les systèmes réalisés dans une bicouche lipidique POPC pure présentaient des conformations légèrement plus ouvertes. D'autre part, nos calculs suggèrent que seul l'angle EC est affecté par la composition de la bicouche lipidique, mais uniquement pour les conformations OF. De même, les rayons de cavité calculés (Fig. 9 supplémentaire) présentaient de petites différences lors de la comparaison des compositions de bicouche lipidique. Même si ces calculs soulignent un impact global relativement limité de la composition membranaire tout en comparant les structures de bMRP1 dans différents modèles de bicouche lipidique, ils n'illustraient pas suffisamment la variabilité dynamique par rapport aux simulations et répliques MD (Figs. 1 à 6 et 9 supplémentaires).

Les paysages conformationnels dépendant des lipides ont été calculés (Figs. 29 et 30 supplémentaires). Pour une conformation et un état lié donnés, les simulations MD peuplaient préférentiellement des régions similaires, quelle que soit la composition lipidique. Cependant, la variabilité structurelle s'est avérée significativement affectée par la composition lipidique. Par exemple, dans la bicouche lipidique POPC pure, des sous-espaces de conformation IF plus ouverts, allant de 30 à 55 Å de distance NBD, ont été échantillonnés. Cet effet était cependant réduit en présence de substrat qui devrait avoir tendance à maintenir plus de contacts entre les TMH et donc à réduire l'ouverture intracellulaire. Les simulations MD effectuées sur POPC: POPE: Chol (2: 1: 1) présentaient une région échantillonnée significativement plus petite, ce qui suggère que la présence de lipides PE tend à fermer la porte intracellulaire des conformations bMRP1 IF, quel que soit l'état lié. D'autre part, en ce qui concerne les conformations OF et l'ouverture extracellulaire, des minima globaux ont été observés de manière intéressante dans le même sous-espace de l'espace conformationnel que les simulations MD réalisées en POPC pur et POPC: Chol (3: 1). Cela suggère un impact limité du cholestérol sur l'ouverture de la porte EC de bMRP1. Cependant, la présence de lipides PE a légèrement déplacé les minima calculés vers des structures OF plus ouvertes, de 13,9 à 18,5°. Les angles d'inclinaison entre les TMH et la bicouche lipidique normale ont été mesurés afin de démêler de légères différences entre les compositions distinctes de la bicouche lipidique (Fig. 31 supplémentaire). Même si aucune conclusion claire ne peut être tirée de ces analyses, les orientations de TMH3, TMH6 et TMH9 sont apparues plus sensibles en l'absence de cholestérol. Tout en considérant que les TMH agissent comme des faisceaux comme indiqué pour ABCB1/P-gp18, l'impact de la membrane bicouche lipidique était plus prononcé sur les orientations d'inclinaison de faisceaux plus petits donnés (Fig. 32 supplémentaire), à ​​savoir les faisceaux C et D consistant respectivement en TMH3/TMH6 et TMH9/TMH12. Fait intéressant, ces faisceaux devraient subir des changements conformationnels plus importants tout au long du cycle de transport18. Cela suggère que même si la composition lipidique semble avoir un impact plutôt limité lors de la comparaison des structures des minima locaux de bMRP1 dans différentes membranes bicouches lipidiques, la composition lipidique devrait affecter les transitions conformationnelles et donc, à son tour, jouer un rôle dans la cinétique du transport du substrat par bMRP1.

Pour mieux comprendre l'interaction entre la bicouche lipidique et bMRP1, une attention particulière a été portée à la structure membranaire de la bicouche lipidique. La plus grande variabilité structurelle de la membrane POPC pure s'expliquait par une structure de bicouche lipidique beaucoup plus fluide illustrée par des paramètres d'ordre inférieur (SCD) pour les queues de palmitate et d'oléate (Fig. 4b). Conformément à la biophysique des bicouches lipidiques pures, la présence de cholestérol module la fluidité des POPC en augmentant l'ordre des lipides, ce qui a entraîné une moindre flexibilité de la membrane de la bicouche lipidique29. Dans une moindre mesure, la présence de lipides PE a potentialisé l'effet structurel du cholestérol, ce qui est en accord avec la variabilité structurelle légèrement inférieure de bMRP1 dans POPC:POPE:Chol (2:1:1) par rapport aux autres membranes bicouches lipidiques. Les calculs d'ordre lipidique suggèrent également un faible impact de la dynamique des protéines sur les structures de la bicouche lipidique. En effet, les simulations IF apo et OF bMRP1-(ATP)2 MD présentaient des profils de queue lipidique légèrement moins ordonnés que IF bMRP1-LTX, bMRP1-(ATP)2 et bMRP1-LTX-(ATP)2. Cela peut s'expliquer par une plus grande variabilité des ouvertures intracellulaires et extracellulaires pour la conformation IF et OF, respectivement, ce qui à son tour est susceptible de conduire à des déplacements plus prononcés des lipides environnants. Les déformations de l'énergie libre de la membrane30 ont également été évaluées pour documenter l'impact des conformations de bMRP1 sur les structures de la bicouche lipidique (tableaux supplémentaires 10 à 12 et figure 4c). Alors que les calculs suggèrent que la présence de bMRP1 déstabilise la structure de la bicouche lipidique POPC pure, la tendance inverse a été observée de manière intéressante dans POPC: POPE: Chol (2: 1: 1) dans lequel la membrane est stabilisée en présence de bMRP1 (ΔGdéformation < 0, voir Fig. 4c). Un comportement intermédiaire a été observé dans la membrane bicouche lipidique POPC:Chol (3:1) pour laquelle la présence de bMRP1 déstabilise globalement la structure de la bicouche lipidique mais dans une mesure significativement moindre que dans la POPC pure. À l'exception des simulations effectuées dans la bicouche lipidique POPC pure, les énergies sans déformation calculées sont plus importantes pour l'état IF apo bMRP1 que pour les autres conformations, probablement en raison de sa plus grande flexibilité susmentionnée en l'absence d'ATP et/ou de substrat.

Des analyses de densité bidimensionnelle lipido-dépendantes ainsi que l'évaluation de la distribution des lipides environnants ont révélé d'importants points chauds de cholestérol et de lipides PE. Par exemple, il a été démontré que les lipides PE se lient préférentiellement à l'hélice du coude pré-TMH7 ainsi qu'à proximité du domaine L0, pendant plus de 50% de la simulation (Fig. 4d, profils de densité 2D calculés dans les Figs supplémentaires 33–36). Les cartes de densité électronique ont révélé trois molécules de cholestérol liées à la structure résolue OF bMRP1 dont deux étaient maintenues près de sa position initiale avec une probabilité supérieure à 50% (Fig. 33 supplémentaire). Fait intéressant, un par le pré-TMH7 est fortement maintenu (plus de 80%) le long des simulations MD, étant orienté en ligne avec l'hélice du coude pré-TMH7, c'est-à-dire parallèlement à la bicouche lipidique (Fig. 4d). Ce point chaud de cholestérol pré-TMH7 a également été observé par exemple dans les simulations IF apo POPC: POPE: Chol (2: 1: 1) (Fig. 4c). Dans une moindre mesure, une deuxième molécule de cholestérol résolue reste en contact avec la protéine, par l'hélice en coude pré-TMH1 (Fig. 33 supplémentaire). Fait intéressant, ce point chaud presque pseudo-symétrique par rapport à l'hélice du coude pré-TMH7 a également été observé dans des simulations réalisées avec des conformations IF bMRP1 (Fig. 4d). Les analyses des voies allostériques ont souligné le rôle clé des molécules de cholestérol proches des hélices coudées pré-TMH1 et -TMH7 dans la transduction de l'information de la poche de liaison au substrat vers les NBS, comme le montre la figure 4e. En effet, l'intermédiarité calculée de ces molécules de cholestérol suggère clairement qu'elles participent activement à la communication allostérique du site de liaison du substrat aux NBS. Enfin, la dernière molécule de cholestérol résolue observée à l'interface entre TMH5 et TMH8 ne reste pas en contact avec le noyau protéique le long des simulations MD. Cependant, les profils de densité 2D calculés du cholestérol suggèrent une probabilité légèrement plus élevée de présence de cholestérol dans cette région, suggérant que la molécule résolue a été échangée le long de la simulation MD. De plus, ces profils ont également révélé des taches de densité plus élevée, telles que la molécule de cholestérol orientée horizontalement par TMH4 (Figs. 35-36 supplémentaires).

bMRP1 est le seul membre de la famille C des exportateurs de médicaments ABC qui a été résolu par cryo-EM jusqu'à présent, étant donné que ABCC7/CFTR est un canal chlorure31 et que les récepteurs de sulfonylurée (ABCC8 et ABCC9) sont impliqués dans la régulation des canaux potassiques32. Au cours de la dernière décennie, une attention particulière a été accordée aux transporteurs MRP, notamment MRP1, MRP2 et MRP4, compte tenu de leurs rôles cliniquement et pharmacologiquement pertinents dans l'élimination des médicaments, comme l'a souligné l'ITC12,13. Contrairement à son cousin ABCB1/P-gp, les connaissances sur la dynamique et les fonctions de MRP1 restent encore fragmentées bien qu'elles aient été résolues dans plusieurs états, tels que les états IF apo et liés au substrat8 et deux états OF sous les conformations pré-4 et post-hydrolyse5, respectivement liées à deux molécules d'ATP ou à la paire ADP/ATP. Dans le présent travail, un ensemble complet de simulations MD tout-atome a été réalisé afin de capturer la dynamique conformationnelle de bMRP1 dans différents états en tenant compte de différents mélanges de modèles de bicouche lipidique, y compris les lipides PC et PE ainsi que le cholestérol. Nous proposons une approche computationnelle basée sur MD afin de (i) compléter les observations expérimentales faites dans les détergents et (ii) mettre en évidence des modèles structuraux qui pourraient être étendus à, au moins, d'autres transporteurs de la famille ABC C.

La dynamique conformationnelle globale dans POPC:POPE:Chol (2:1:1) montre des variations significatives des structures IF par rapport aux structures cryo-EM. Dans les états IF, la fermeture spontanée des NBD a été systématiquement observée indépendamment de la présence de molécules d'ATP, comme illustré par les valeurs d'angle IC et de distance NBD qui ont toutes convergé vers le même sous-espace. En ce qui concerne l'espace conformationnel ABC, la présence de molécules d'ATP dans les NBS ou le substrat dans la poche de liaison TMD modifie principalement la dynamique de la dimérisation NBD en modulant la valeur de torsion NBD (Fig. 2b et Fig. 5 supplémentaire). Par conséquent, nos simulations MD sont en parfait accord avec les observations récentes selon lesquelles les structures IF largement ouvertes peuvent être peu probables dans les environnements membranaires natifs. On pense donc que les structures largement ouvertes observées dans les expériences cryo-EM sont dues à des artefacts dus à l'utilisation d'environnements non physiologiques pour la résolution de la structure7, en accord avec les différences structurelles observées, par exemple, pour la P-gp reconstituée soit dans des détergents, soit dans des nanodiscs11. La délétion de NBD1 13 acides aminés, telle que l'absence de la structure "ball-and-socket" pour NBD1, pourrait affaiblir le couplage entre NBD1 et TMH10/TMH11. En l'absence de substrat, cela est associé à une plus grande flexibilité de traduction concernant NBD1 conduisant à l'ouverture du dimère NBD. Cependant, en présence de molécules d'ATP et de substrat, seules des conformations de dimères NBD proches ont été observées (Fig. 2a), mettant en évidence la communication allostérique entre les TMD et les deux NBS. En raison du couplage plus faible entre TMH10/TMH11 et NBD1, on s'attend à ce que l'allostérie entre les TMD et les NBD soit principalement médiée par NBD2. Fait intéressant, NBS1 s'est également formé même en l'absence de molécules d'ATP (Fig. 2a). Cela pourrait également expliquer pourquoi des transitions IF à OF ont été observées expérimentalement même en l'absence de molécules d'ATP5. Cependant, de telles hypothèses doivent être soigneusement prises en compte compte tenu de la résolution récente d'un transporteur ABC dégénéré NBS adoptant une conformation IF largement ouverte au moyen de cryo-EM utilisant des nanocorps33. Nos résultats mettent en évidence l'importance de l'asymétrie NBD et NBS en tant qu'évolution des transporteurs ABC pouvant résulter d'une économie d'énergie tout en conservant la fonction de transport en nécessitant une seule hydrolyse de l'ATP.

MRP1 devrait transporter principalement des substrats amphiphiles anioniques contrairement à la P-gp qui transporte principalement des substrats hydrophobes2. En accord avec les observations structurelles, l'accès au substrat directement à partir des régions de queue lipidique à haute ou basse densité de la membrane est très peu probable en raison de l'absence d'un canal d'accès dans la bicouche lipidique contrairement à P-gp8. Cependant, les substrats amphiphiles pourraient se répartir dans la région de la tête polaire à haute densité. Par conséquent, l'accès au substrat MRP1 devrait se produire soit directement à partir du cytoplasme, soit à partir de la région de la tête polaire à haute densité, pour laquelle l'accès pourrait être possible via TMH4 et TMH6 (Fig. 37 supplémentaire). De l'autre côté de bMRP1, nos simulations MD suggèrent que l'accès au substrat entre TMH10 et TMH12 peut être moins probable pour les substrats volumineux. Cependant, de telles hypothèses nécessitent d'autres investigations biochimiques et structurelles.

Dans le présent travail, nous avons également étudié l'interaction entre les membranes bicouches lipidiques et la dynamique des protéines. Tout d'abord, il est important de noter que les simulations actuelles ont été effectuées pendant quelques μs pour chaque réplique. Compte tenu de l'échelle de temps des processus de transport, les résultats actuels ne peuvent être utilisés que pour déchiffrer l'interaction lipide-protéine dans les régions d'équilibre des différents états conformationnels. En jouant avec différents modèles de bicouches lipidiques telles que les membranes sans cholestérol et sans PE, la dynamique de bMRP1 est modulée. Conformément aux études biophysiques précédentes, la présence de cholestérol dans la membrane à base de PC a augmenté la rigidité de la membrane, ce qui a réduit la dynamique conformationnelle de MRP129. L'impact des lipides PE sur les structures minimales locales devrait être plutôt limité pour les états IF. Cependant, il est intéressant de noter que l'ouverture EC sous conformation OF est apparue plus favorable en présence de PE (Fig. 4a). Globalement, nos résultats suggèrent également que la structure de MRP1 est susceptible d'adopter une structure similaire pour un état donné, quelle que soit la composition de la bicouche lipidique. Cependant, cela peut jouer un rôle dans les transitions conformationnelles et la cinétique. Cette hypothèse doit être considérée avec prudence pour les autres transporteurs MRP. En effet, contrairement à, par exemple, MRP2 et MRP4, MRP1 est un exportateur omniprésent qui a été observé dans différents types de cellules pour lesquelles la composition de la bicouche lipidique peut différer. Nous pouvons donc en déduire que d'autres membres du MRP pourraient devenir plus sensibles aux compositions membranaires bicouches lipidiques.

En dehors du rôle physique de la bicouche lipidique sur la dynamique des protéines, nos résultats confirment que les composants lipidiques jouent également un rôle actif dans la fonction de transport. Conformément aux observations informatiques faites sur d'autres protéines membranaires11, 26, 34, 35, les composants lipidiques sont impliqués dans l'allostérie des TMD aux NBD. Plus important encore, la liaison du cholestérol aux hélices coudées pré-TMH1 et pré-TMH7 est fortement impliquée dans ces voies allostériques. De telles découvertes ouvrent la voie concernant le rôle du motif lasso pré-TMD (L0) qui s'est avéré nécessaire pour la fonction de transport MRP18,17. Même si le rôle des lipides peut sembler limité sur MRP1 par rapport à d'autres récepteurs et canaux membranaires, une plus grande attention devrait être accordée aux interactions lipides-protéines, non seulement en ce qui concerne l'impact biophysique sur la dynamique des protéines, mais aussi en tant que modulateur de transport comme récemment proposé pour P-gp11.

Le présent travail a fourni des informations structurelles sur la fonction et l'interaction lipide-protéine des transporteurs ABCC dégénérés du NBS pour des investigations supplémentaires telles que le rôle des MRP dans la pharmacocinétique locale, y compris, par exemple, l'impact des mutations/polymorphismes rares ainsi que le déséquilibre lipidique membranaire basé sur la maladie vers la médecine personnalisée.

Afin d'avoir une vue d'ensemble des structures jalonnant le cycle de transport de bMRP1, différentes conformations et états liés ont été pris en compte dans la présente étude : IF apo bMRP1, IF bMRP1-(ATP)2, IF bMRP1-LTX, IF bMRP1-LTX-(ATP)2 et OF bMRP1-(ATP)2. Les structures cryo-EM ont été utilisées comme structures de départ pour les conformations IF (PDB ID : 5UJ98 et 5UJA8) et OF (PDB ID : 6BHU4). La conformation de l'OF a été résolue à l'aide du mutant E1454Q qui s'est avéré réduire le taux d'hydrolyse de l'ATP, favorisant ainsi la détermination de la structure de l'OF4. Cette mutation a été annulée manuellement pour la présente étude. Le soi-disant TMD0 n'a pas été inclus dans les modèles actuels car il a déjà été démontré qu'il n'affecte pas le transport du substrat3,4,8. Cependant, il a été montré que le soi-disant domaine lasso pré-TMH1 (L0) est obligatoire pour la fonction MRP1 alors qu'il n'était pas totalement résolu dans les structures cryo-EM MRP18,17. Les parties manquantes du domaine L0 ont été modélisées à l'aide du serveur I-Tasser (Iterative Threading ASSEmbly Refinement) ou du modeleur v9.2337 pour les conformations IF et OF, respectivement. En effet, I-Tasser n'a initialement pas réussi à prédire un domaine L0 cohérent pour l'état OF bMRP1-(ATP)2 par rapport au modèle IF. Par conséquent, par souci de cohérence, le domaine OF bMRP1-(ATP)2 L0 a été construit à l'aide du modeleur v9.23 basé sur la séquence, mais également sur le modèle de domaine IF L0 comme modèle (tableau supplémentaire 13). Pour assurer la cohérence entre les modèles de domaine L0, la structure et la dynamique ont été surveillées en évaluant RMSF sur les simulations MD, mais également en comparant les structures finales du modèle de domaine L0 qui ont convergé vers des structures secondaires similaires (Figs. 38 et 39 supplémentaires). De même, la boucle manquante entre TMH6 et NBD1 a également été ajoutée dans les modèles actuels.

Les conformations IF ont été construites dans différents états liés, à savoir les états liés apo, ATP2-, LTX- et LTX-(ATP)2, tandis que la conformation OF a été uniquement construite dans l'état lié à ATP2. IF bMRP1-(ATP)2 et IF bMRP1-LTX-(ATP)2 ont été construits en superposant séparément NBD de 5UJ9 et 5UJA, respectivement sur les NBD de conformation OF dans laquelle les molécules ATP et Mg2+ sont liées aux NBS. Tous les modèles finaux ont été rapidement minimisés dans le vide à l'aide du package Amber1838,39 pour éviter les conflits stériques non physiques.

Le générateur d'entrée CHARMM-GUI40,41 a été utilisé pour intégrer les différents modèles bMRP1 dans différentes bicouches lipidiques, à savoir POPC pur, POPC:Chol (3:1) et POPC:POPE:Chol (2:1:1) en tirant parti des coordonnées bMRP1 obtenues à partir de la base de données OPM (Orientations of Proteins in Membranes)42. Les structures IF apo bMRP1 et OF bMRP1-(ATP)2 ont également été intégrées dans des bicouches lipidiques pures POPE et POPC: POPE (3: 1) afin d'étudier spécifiquement les interactions lipides-protéines avec les lipides PE. La structure cryo-EM résolue de OF bMRP1-(ATP)2 comprend également trois molécules de cholestérol résolues qui ont été conservées pendant toutes les simulations afin d'étudier leur importance. De ces différentes compositions de bicouches lipidiques, le mélange POPC:POPE:Chol (2:1:1) est apparu le plus pertinent pour modéliser les membranes cellulaires. Les autres types de membranes ont été considérés pour aider à comprendre le rôle de chaque lipide dans la dynamique des protéines. La taille totale d'origine de chaque système était d'env. 120 × 120 × 180 Å3 (voir le tableau supplémentaire 14 pour les descriptions du système). Pour imiter les conditions physiologiques, du NaCl 0,15 M a été utilisé et les systèmes ont été solvatés à l'aide de molécules d'eau explicites TIP3P43,44,45. Les systèmes finaux sont constitués d'env. 245 000 atomes (voir les détails dans le tableau supplémentaire 14).

Les sorties CHARMM-GUI40,41 ont été converties au format Amber à l'aide des scripts AmberTools38,39 (à savoir, charmmlipid2amber.py et pdb4amber). En ce qui concerne les systèmes liés à l'ATP2 et à la LTX, le substrat, les nucléotides et les ions Mg2+ ont été ajoutés après la construction des systèmes protéine-lipide ; par conséquent, la neutralité a été assurée en éliminant au hasard le nombre correspondant de contre-ions. Amber FF14SB46, Lipid1747 et les champs de force DNA.OL1548,49 modifiés ont été utilisés pour modéliser respectivement les résidus de protéines, les lipides et les molécules d'ATP. Les molécules d'eau, les ions Mg2+ et les contre-ions ont été modélisés à l'aide du modèle d'eau TIP3P43,44,45 ainsi que des paramètres d'ions monovalents et divalents correspondants de Joung et Cheatham50,51. Les paramètres du substrat LTX (leucotriène C4) ont été dérivés de la version 2 du champ de force ambre généralisé (GAFF2)52 à l'aide du logiciel Antechamber53. Les charges atomiques partielles LTX ont été dérivées de calculs basés sur la mécanique quantique au niveau de la théorie HF/6-31G*, en utilisant le serveur RED54. Chaque système a été simulé avec des conditions aux limites périodiques. Le seuil pour les interactions non liées était de 10 Å pour les potentiels de Coulomb et de van der Waals. Les interactions électrostatiques à longue portée ont été calculées à l'aide de la méthode d'Ewald à mailles de particules55.

La minimisation et la thermalisation des systèmes et les simulations MD ont été réalisées avec les packages Amber18 et Amber2038,39 en utilisant les versions CPU et GPU PMEMD. La minimisation a été réalisée en quatre étapes en minimisant séquentiellement : (i) les atomes O de l'eau (20 000 étapes) ; (ii) toutes les liaisons impliquant des atomes H (20 000 pas) ; (iii) les molécules d'eau et les contre-ions (50 000 pas) et (iv) l'ensemble du système (50 000 pas). Chaque système a ensuite été thermalisé en deux étapes : (i) les molécules d'eau ont été thermalisées à 100 K pendant 50 ps dans des conditions d'ensemble (N,V,T) en utilisant une intégration temporelle de 0,5 fs ; (ii) l'ensemble du système a ensuite été thermalisé de 100 K à 310 K pendant 500 ps dans des conditions d'ensemble (N,P,T) avec un pas de temps de 2 fs dans des conditions semi-isotropes. Ensuite, chaque système a été équilibré pendant 5 ns dans des conditions d'ensemble (N,P,T) avec un pas de temps de 2 fs dans des conditions semi-isotropes, en utilisant le barostat Berendsen. Les cycles de production ont ensuite été effectués à l'échelle de la microseconde avec un pas de temps d'intégration de 2 fs dans des conditions d'ensemble (N, P, T) avec une échelle semi-isotrope. La température a été maintenue à l'aide du thermostat dynamique de Langevin56 avec une fréquence de collision de 1,0 ps−1. Une pression constante fixée à 1 bar a été maintenue avec une échelle de pression semi-isotrope en utilisant soit le barostat Berendsen57 pour IF apo bMRP1 et OF bMRP1-(ATP)2, soit le barostat Monte Carlo pour IF bMRP1-(ATP)2, IF bMRP1-LTX et IF bMRP1-LTX-(ATP)2. Ce dernier a été utilisé pour accélérer le temps de calcul.

Afin d'assurer l'arrimage de l'ATP dans le NBS, des simulations de retenue-MD ont été réalisées en utilisant une approche similaire à celle proposée par Wen et al.58. Peu de temps après, un ensemble de contraintes basées sur la distance a été appliqué entre les résidus tryptophane/tyrosine de la boucle A (Trp653 et Tyr1301, respectivement pour NBD1 et NBD2) et le fragment purine ATP correspondant. L'arrangement Mg2+-ATP-NBD a été maintenu en appliquant des contraintes entre les ions Mg2+ et les groupes phosphate ATP ainsi qu'entre les ions Mg2+ et la sérine Walker A et le résidu glutamine Q-loop (à savoir, Ser685 et Gln713 pour NBD1 et Ser1333, Gln1374 pour NBD2). De plus, les fragments phosphate d'ATP ont également été retenus par les résidus Walker A environnants. Toutes les distances ont été retenues à l'aide de potentiels harmoniques pour lesquels les distances minimales et les constantes de force sont indiquées dans les tableaux supplémentaires 15–16. Des contraintes basées sur la distance ont été appliquées pour les étapes de thermalisation et d'équilibrage de la boîte. Ils ont ensuite été éliminés en douceur au cours des 10 premières ns de cycles de production. Les contraintes pour les ions Mg2+ ont été maintenues pendant toute la simulation.

Les instantanés ont été enregistrés toutes les 100 ps. Pour chaque système, trois répliques ont été réalisées pour mieux échantillonner l'espace conformationnel local. Chaque cycle de production a été effectué pendant 2, 0 à 2, 5 μs et 1, 5 à 2, 0 μs, respectivement pour les modèles IF et OF (tableau supplémentaire 17). En effet, les simulations effectuées à l'aide du modèle OF ont atteint l'équilibre plus rapidement que les conformations IF (voir les RMSD dépendant du temps dans la Fig. 40 supplémentaire). Dans la présente étude, le temps MD total agrégé est de 112,4 μs.

Les simulations ont été analysées à l'aide du package CPPTRAJ59 et de scripts Python internes tirant parti du module MDAnalysis60,61. Les tracés ont été obtenus à l'aide du package Python matplotlib v3.3.162. La visualisation et le rendu de la structure ont été préparés à l'aide du logiciel VMD63 (v1.9.3 et l'alpha-v1.9.4). Les paramètres structurels dits ABC (c'est-à-dire l'angle IC, l'angle EC, la distance NDB, la torsion NBD et la distance EC) ont été calculés en utilisant la même définition que celle proposée par Hofmann et al.1 pour l'angle IC, l'angle EC, la distance EC et la distance NBD ou Moradi et al.18 pour la torsion NBD. En bref, l'angle IC décrit l'ouverture IC de l'entrée du substrat et est défini par l'angle entre deux vecteurs ; à la fois à partir du centre de masse de toute la région extracellulaire et dirigé soit vers la région IC de TMH1, TMH2, TMH3, TMH6, TMH10 et TMH11, soit vers la région IC de TMH4, TMH5, TMH7, TMH8, TMH9 et TMH12. De même, l'angle EC décrit l'ouverture EC pour la libération du substrat et est défini par l'angle entre deux vecteurs partant du centre de masse des deux NBD et dirigé vers la région EC de TMH1, TMH2, TMH9, TMH10, TMH11 et TMH12 ou la région EC de TMH3, TMH4, TMH5, TMH6, TMH7 et TMH8. La distance EC a été définie comme la distance entre les régions EC de TMH1, TMH2, TMH9, TMH10, TMH11 et TMH12 et la région EC de TMH3, TMH4, TMH5, TMH6, TMH7 et TMH8. La distance NBD a été définie comme la distance entre les deux centres de masse NBD. Étant donné que ces définitions ont été appliquées aux modèles MD actuels de bMRP1 mais également aux structures résolues disponibles d'autres transporteurs ABC, les régions intracellulaires et extracellulaires ont été définies sur la base de l'épaisseur de membrane proposée dans la base de données OPM42. Les sélections de résidus pour chaque système et chaque paramètre de structure sont rapportées dans le tableau supplémentaire 1. Pour chaque système et chaque bicouche lipidique, le paysage local d'énergie libre a été calculé à l'aide de l'approche InfleCS qui tire parti des modèles de mélange gaussien (GMM)23,64. Les paramètres structurels (c'est-à-dire les angles IC et EC, la distance NBD et la torsion) ont été pris pour surveiller le paysage d'énergie libre en utilisant une taille de grille fixée à 80, de 2 à 12 composantes gaussiennes pour chaque GMM obtenu par un maximum de 20 itérations. La pertinence de l'approche InfleCS repose fortement sur la qualité de l'échantillonnage lors des simulations MD. Dans le présent travail, InfleCS ne représente que le paysage d'énergie libre autour des minima locaux échantillonnés lors de nos simulations MD. De plus, l'échantillonnage MD et la pertinence d'InfleCS pour les systèmes actuels ont été assurés en calculant séparément les profils de convergence pour chaque paramètre structurel (Figs. 41–43 supplémentaires).

Le profil des pores d'eau de la cavité bMRP1 TM a été calculé à l'aide du logiciel Hole2.265 en prenant des instantanés toutes les 10 ns. Le profil moyen des pores TM a été calculé en faisant la moyenne de la partie équilibrée des trajectoires en tenant compte de toutes les répliques. L'évolution des pores TM en fonction du temps depuis le début a également été calculée à des profondeurs sélectionnées dans la membrane bicouche lipidique (z = 18, 5, -15 et -22 Å) en amorçant toutes les 100 ns le long des trajectoires MD (c'est-à-dire 10 instantanés × 3 répliques chaque 100 ns). Les profils ont ensuite été moyennés et les profils de densité z des atomes PC P ont été utilisés pour définir le centre de la membrane bicouche lipidique (z = 0). En ce qui concerne les angles d'inclinaison, tous les systèmes ont été alignés sur le modèle OF bMRP-(ATP)2 intégré dans POPC:POPE:Chol (2:1:1). Les distributions de lipides ont été obtenues à l'aide du package CPPTRAJ59. Les taux d'occupation des lipides ont été calculés pour chaque tête polaire (c'est-à-dire PE ou PC) ou toute molécule de cholestérol autour de la protéine, en considérant les seuils d'occupation à 50 ou 80 %. Les densités lipidiques dépendantes des feuillets ont été calculées à l'aide du mot-clé de la grille dans CPPTRAJ en se concentrant sur les lipides de la tête polaire (PE ou PC) ou le groupe OH du cholestérol. L'accent a été mis uniquement sur la région de la tête polaire à haute densité obtenue en surveillant les pics de densité dépendant de z des atomes de phosphate pour les lipides PC et PE ou l'atome O pour les molécules de cholestérol. Les épaisseurs de membrane ont été obtenues à l'aide du MEMBPLUGIN pour VMD63,66. La déformation de l'énergie libre a été évaluée en calculant le coût de l'énergie libre de la déformation de la membrane en présence de bMRP1 ainsi que les références d'énergie libre pour les membranes planes, à l'aide du logiciel CTMDapp30. Tous les paramètres utilisés pour ces calculs sont indiqués dans le tableau supplémentaire 18. Compte tenu de l'échantillonnage actuel, de la taille de la protéine et de la pertinence des modules de flexion et de compressibilité dans les simulations actuelles de tous les atomes, les résultats présentés à la figure 4c sont discutés qualitativement.

Des analyses en composantes principales ont également été effectuées à l'aide du package CPPTRAJ59, en se concentrant sur le noyau ABC, défini par les atomes du squelette de TMH1 à TMH12, NBD1 et NBD2. Les variabilités du système ont été étudiées en effectuant une PCA indépendante pour chaque système pour lequel chaque réplique était alignée sur une structure moyenne du système. Les analyses de réseau ont été effectuées à l'aide du plug-in VMD Network Analysis63,67. Les matrices dynamiques de corrélation croisée (DCCM) ont été calculées séparément pour chaque réplique sur laquelle les atomes Cα ont été sélectionnés comme nœuds et toutes les restrictions par défaut (notSameResidue, notNeighboringCAlpha, notNeighboringPhosphate, notNeighboringResidue) ont été appliquées. Les communautés ont ensuite été calculées à l'aide de gncommunities67. Les voies du réseau allostérique ont été déterminées à l'aide de la récente approche Allopath développée par Westerlund et al.26,27. En peu de temps, "l'efficacité de la communication" distante entre deux domaines a été obtenue à partir de la carte de contact et de la matrice d'information mutuelle des résidus protéiques ainsi que des interacteurs non protéiques tels que les lipides environnants et les molécules liées (par exemple, les nucléotides et le substrat). Une telle approche fournit également un profil d'intermédiarité qui décrit l'implication de chaque composant (c'est-à-dire, résidu, lipide, substrat et nucléotide). Pour chaque molécule lipidique, trois nœuds ont été définis correspondant au groupe de tête polaire et aux deux queues lipidiques (Fig. 44 supplémentaire). L'ATP a également été divisé en trois nœuds : les fragments purine et ribose ainsi que la queue triphosphate. Le substrat LTX a été divisé en trois nœuds : fragment glutathion, queue poly-insaturée et acide hydroxypentanoïque. Les ions Mg2+ et les molécules de cholestérol ont été considérés comme un nœud chacun. Les sélections d'atomes par nœud sont rapportées dans la Fig. 44 supplémentaire. Les voies allostériques ont été calculées à partir de la poche de liaison du substrat à chaque NBS, séparément, comme défini dans le tableau supplémentaire 9. Des analyses de liaison H (Figs. 45 et 46 supplémentaires) ont été effectuées à l'aide de CPPTRAJ59 dans lequel les seuils de distance et d'angle ont été fixés à 3, 5 Å et 120 °, respectivement. Le DCCM calculé à l'aide de CPPTRAJ est également disponible dans les figures supplémentaires. 47–50. Les descriptions structurelles des minima locaux ont été effectuées uniquement sur la partie équilibrée des simulations MD, c'est-à-dire en considérant les 800 dernières ns comme indiqué à partir des profils RMSD rapportés à la Fig. 41 supplémentaire.

Pour toutes les analyses MD décrites dans cet article, les données ont été dérivées de n = 3 simulations MD pour chaque état (c.-à-d. IF apo bMRP1, bMRP1-LTX, bMRP1-(ATP)2, bMRP1-LTX-(ATP)2 et OF bMRP1-(ATP)2) et des membranes bicouches lipidiques (c.-à-d. POPC pur, POPC:Chol (3:1) et POPC:POPE:Chol (2:1:1) pour tous les états mais aussi POPE pur et POPC:POPE (3:1) pour IF apo bMRP1 et OF bMRP1-(ATP)2). Autrement dit, 19 systèmes ont été considérés, pour 57 simulations. Les analyses ont été effectuées systématiquement en considérant chaque système indépendamment. Les moyennes et les écarts-types ont généralement été obtenus en extrayant les données de chaque réplique pour afficher la variabilité conformationnelle de l'échantillonnage. Pour les analyses des liaisons H, la déformation de l'énergie libre et les communications allostériques, les résultats ont été calculés pour chaque réplique séparément et les écarts et erreurs moyens et standard ont été obtenus sur les trois répliques traitées indépendamment.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les ensembles de données générés à partir des simulations MD menées dans ce travail sont disponibles auprès des auteurs sur demande raisonnable. Les données source sous-jacentes aux résultats et à l'intrigue présentés dans les figures principales, les entrées MD ainsi que les configurations de coordonnées initiales et finales pour chaque état et modèle lipidique, et les films supplémentaires 1 à 5 peuvent être téléchargés sur le lien d'accès Zenodo suivant : https://doi.org/10.5281/zenodo.7541178.

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Les auteurs remercient le Dr Benjamin Chantemargue et le Dr Mehdi Benmameri pour des échanges scientifiques stimulants et fructueux. Nous remercions Xavier Montagutelli du département informatique de l'Université de Limoges pour son support technique concernant les supercalculateurs. Les calculs ont été effectués sur les supercalculateurs CALI ("CAlcul en LImousin") et "Baba Yaga" hébergés par l'Université de Limoges, ainsi que sur le supercalculateur national "Jean-Zay" des ressources IDRIS HPC, dans le cadre des allocations 2020-A0080711487 et 2021-A0100711487 faites par GENCI. Ce travail a été soutenu par des subventions de l'Agence Nationale de la Recherche (ANR-19-CE17-0020-01 IMOTEP et ANR-21-CE18-0030 RAPRACLID), de la Région Nouvelle Aquitaine et de l'Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM, AAP-NA-2019-VICTOR).

Inserm U1248 Pharmacologie & Transplantation, Institut ΩSanté—Univ. Limoges, 2 rue du Pr Descottes, 87000 F, Limoges, France

Ágota Tóth, Angelika Janaszkiewicz, Veronica Crespi & Florent Di Meo

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À. et FDM a conçu l'étude. À. et FDM a réalisé toutes les simulations. Á.T., AJ, VC et FDM ont analysé les simulations. À. et FDM ont interprété les résultats et en ont discuté avec AJ et VC Á.T. et FDM a rédigé le manuscrit et il a été édité, révisé et approuvé par tous les auteurs.

Correspondance à Florent Di Meo.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Mahmoud Moradi et Shuguang Yuan pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef de la manipulation principale : Yun Lyna Luo et Gene Chong. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Tóth, Á., Janaszkiewicz, A., Crespi, V. et al. Sur l'interaction entre les lipides et la dynamique asymétrique d'un transporteur ABC dégénéré NBS. Commun Biol 6, 149 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04537-3

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Reçu : 20 mai 2022

Accepté : 25 janvier 2023

Publié: 03 février 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04537-3

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