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Aug 10, 2023

VIH dynamique

Volume Communication Nature

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 6393 (2022) Citer cet article

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Les vaccins ciblant la protéine de pointe gp160 du VIH-1 sont contrecarrés par des taux de mutation virale élevés et une chicanerie structurelle. La région externe proximale de la membrane (MPER) de gp160 est la cible d'anticorps neutralisants à large spectre (bnAbs) d'origine naturelle, mais les vaccins à base de MPER ne parviennent pas à générer des bnAbs. Ici, la protéine de pointe intégrée au nanodisque a été étudiée par microscopie cryoélectronique et simulations de dynamique moléculaire, révélant une inclinaison spontanée de l'ectodomaine qui crée une vulnérabilité au VIH-1. Alors que chaque protomère MPER rayonne au centre vers l'axe triple contribuant à une structure de trépied associée à la membrane qui est occluse dans la pointe verticale, l'inclinaison permet d'accéder au MPER opposé. Les structures des protéines de pointe avec les Fab 4E10 bnAb liés révèlent que l'anticorps se lie au MPER exposé, modifiant ainsi la dynamique du MPER, modifiant l'inclinaison moyenne de l'ectodomaine et imposant une contrainte sur la membrane virale et les segments transmembranaires de la pointe, entraînant l'abrogation de la fusion membranaire et informant le développement futur de vaccins.

On pense que la genèse du virus de l'immunodéficience humaine-1 (VIH-1) en tant qu'agent pathogène chez Homo sapiens s'est produite en République démocratique du Congo vers 1920, suite au passage du rétrovirus du chimpanzé à l'homme, suivi du déclenchement de l'épidémie actuelle dans les années 19701,2. Attestant de l'importance de cette zoonose, les données compilées au cours des 35 dernières années indiquent qu'environ 78 000 000 d'individus dans le monde ont été infectés et qu'environ 35 000 000 sont décédés malgré un traitement médicamenteux antiviral multi-agents3.

La protéine de pointe d'enveloppe trimérique gp160 HIV-1 (Env), une glycoprotéine transmembranaire comprenant trois protomères chacun de gp120 et gp41, est la protéine singulière dérivée du virus sur le virion. Par conséquent, c'est la seule cible des anticorps protecteurs apparaissant naturellement chez les patients ou pouvant être induits chez des individus non infectés par la vaccination4,5,6. Cela dit, l'induction par le vaccin d'anticorps avec la largeur requise contre diverses souches virales, appelés anticorps largement neutralisants (bnAbs), n'a pas réussi à engendrer des anticorps qui bloquent la liaison initiale du virus aux cellules T CD4 humaines ou qui inhibent les changements conformationnels Env ultérieurs et les événements de fusion associés nécessaires à l'entrée virale post-liaison dans la cellule hôte (examiné dans la réf. 7). La reconnaissance immunitaire d'Env est entravée par son extraordinaire variabilité de séquence8, sa glycosylation dense9,10 et le masquage conformationnel des sites clés et de l'état métastable11. Néanmoins, certains patients infectés de manière chronique par le VIH-1 développent des bnAb au fil des années d'infection4,5,6. La diversification virale associée et les mutations somatiques étendues des anticorps améliorent l'affinité de liaison, optimisant ainsi la correspondance entre les paratopes et les épitopes12. Les BnAb sont dirigés contre le site de liaison CD4 ainsi que les sites glycanes V1V2 et V3 sur gp120, la région d'interface gp41-gp120 et la région externe proximale de la membrane gp41 (MPER)4,5,6. Le MPER, qui relie l'ectodomaine Env à son domaine transmembranaire (TM), fait partie des segments du VIH-1 les plus conservés parmi les souches de clade13. Cette conservation et l'observation selon laquelle les bnAb ciblant MPER d'origine naturelle manifestent la plus large étendue de neutralisation ont désigné le MPER comme une cible clé pour la conception de vaccins.

La structure du MPER seul et avec le domaine TM dans un environnement mimétique de la membrane a été largement étudiée par des méthodes spectroscopiques, établissant que le peptide MPER a tendance à adopter une conformation hélice-charnière-hélice coudée intégrée à la membrane avec une flexibilité flanquante supplémentaire13,14 et suggérant que le MPER lié à bnAb est partiellement extrait de la membrane15. Cependant, les vaccins peptidiques MPER n'ont pas réussi à susciter des bnAb et la disposition exacte du MPER dans le cadre de l'ensemble du trimère Env intégré à la membrane reste controversée. Une étude de tomographie cryo-électronique (cryo-ET) a rapporté que les MPER forment une structure en forme de trépied composée de trois hélices séparées16, mais d'autres études cryo-ET ont montré que les trois segments MPER sont organisés en une tige compacte17,18. Par conséquent, à des fins de conception rationnelle de vaccins, une structure à haute résolution est nécessaire pour élucider la disposition réelle du MPER dans le contexte à la fois d'une bicouche lipidique et de l'ectodomaine complet et glycosylé du trimère Env.

Ici, nous reconstituons la protéine Env du VIH-1 exprimée par des cellules de mammifères dans des nanodisques lipidiques et utilisons la microscopie cryoélectronique à une seule particule (cryo-EM) pour déterminer sa structure seule ainsi qu'en complexe avec jusqu'à trois Fab du bnAb 4E10. Associées à des simulations de dynamique moléculaire à gros grains (CGMD), ces structures révèlent la dynamique de l'ectodomaine Env et du MPER sur la membrane. De plus, les changements conformationnels dans le MPER ainsi que les perturbations déduites dans les lipides vicinaux et les domaines TM qui accompagnent la liaison d'un nombre croissant de ces Fab 4E10 sont vérifiés.

La construction gp145 SOSIP19 de la protéine de pointe Env de la souche BG505 du clade A, constituée de l'ensemble de l'ectodomaine (résidus 1 à 662), des segments MPER et transmembranaire et de 17 résidus du domaine cytoplasmique (Fig. 1a), a été exprimée dans des cellules HEK293. La construction Env tronquée en C-terminal a été utilisée en raison de sa bien meilleure expression par rapport à la protéine pleine longueur. Après purification dans du dodécyl maltoside (DDM) à l'aide du Fab PG9 pour chromatographie d'affinité suivie d'une chromatographie d'exclusion de taille (SEC) (Fig. 1a, b supplémentaires), la gp145 recombinante a été reconstituée en nanodisques avec un mélange molaire 1,5: 1: 1, 07 de palmitoyl oléyl phosphatidylcholine (POPC), de palmitoyl oléyl phosphatidylglycérol (POPG) et de cerveau polaire extrait lipidique. Ce mélange de lipides a une composition similaire à celle de la membrane du VIH-120, sauf qu'il manque de cholestérol. Même si le cholestérol est le composant le plus abondant du lipidome du VIH-1, nos simulations CGMD réalisées avec une membrane contenant 20 % de cholestérol ont montré un comportement dynamique de l'ectodomaine, en particulier des angles d'inclinaison, cohérents avec ceux observés dans nos cartes cryo-EM (voir ci-dessous). Les nanodisques vides ont été retirés par SEC (Fig. 1a supplémentaire). L'analyse SDS-PAGE de la fraction de pic SEC a confirmé la présence à la fois de gp145 et de la protéine d'échafaudage membranaire MSP1D1dH5, qui a été utilisée pour l'assemblage de nanodisques (Fig. 1b supplémentaire). Les images EM de la gp145 colorée négativement dans le DDM montraient principalement des vues de dessus à triple symétrie de la gp145 (Fig. 1c supplémentaire), tandis que les images EM à coloration négative de la gp145 intégrée au nanodisque montraient des vues latérales et révélaient les nanodisques (Fig. 1d supplémentaire). La gp145 intégrée au nanodisc a ensuite été incubée avec le fragment Fab de bnAb 4E10, réticulée avec BS3 et vitrifiée sur des grilles. Le traitement d'image avec RELION-3 a montré qu'environ 80 % des particules sélectionnées n'avaient pas de densité évidente pour le Fab 4E10. Un traitement ultérieur de ces particules a donné une carte de densité de la gp145 intégrée au nanodisque à une résolution globale de 3, 9 Å (Fig. 1b et Fig. 2 à 4 supplémentaires). Cette carte nous a permis de construire un modèle atomique pour les résidus d'ectodomaine 31 à 662 et un modèle de squelette pour les résidus 663 à 671 (voir "Méthodes" pour plus de détails). La carte n'a pas résolu les hélices transmembranaires, qui n'étaient pas non plus résolues dans une carte précédente de la protéine Env pleine longueur intégrée au nanodisc21, très probablement le résultat de variations dans la position des domaines TM à portée unique par rapport au nanodisc. Cependant, une densité supplémentaire à basse résolution (~ 5 Å; Fig. 4b supplémentaire) représentait le début du segment MPER-N, dans lequel nous avons placé le segment N-terminal d'une structure RMN du MPER (PDB: 2PV6) 14 (Fig. 4d supplémentaire), révélant ainsi la disposition du MPER dans le contexte d'une membrane et de l'ectodomaine Env trimérique. Les segments MPER-N de chaque protomère forment trois hélices indépendantes qui adoptent une conformation en forme de trépied (Fig. 1b, c), qui diffère des structures précédemment rapportées dans lesquelles les MPER convergent16 ou forment une tige compacte17,18.

une architecture de domaine de gp160. FP, peptide de fusion ; NHR, répétition heptade N-terminale; CHR, répétition heptade C-terminale (orange); MPER-N (vert); MPER-C (magenta); TM, domaine transmembranaire ; TDM, queue cytoplasmique. Les nombres au-dessus indiquent les premiers résidus des segments et les nombres en dessous du dernier. b Gauche : carte Cryo-EM de la gp145 intégrée au nanodisque à un niveau de contour bas (0,011). La densité du nanodisque est indiquée en jaune clair. Droite : carte Cryo-EM de la gp145 intégrée au nanodisque à un niveau de contour supérieur (0,014) représentée en gris semi-transparent, avec la structure modélisée de la gp145, représentée en ruban, adaptée à la carte. La région CHR est représentée en orange et le segment MPER-N en vert. Le reste de l'ectodomaine est représenté en bleu. c Gauche : Structure de gp145 vue parallèle (en haut) et perpendiculaire au plan de la membrane (en bas). Droite : Mêmes vues que dans le panneau de gauche après avoir ajouté la structure RMN du MPER complet (PDB : 2PV6) à notre modèle gp145 (basé sur une superposition des segments MPER-N). La région CHR est représentée en orange, le segment MPER-N en vert et le segment MPER-C en magenta. d Placement des deux structures RMN disponibles de MPER-TM dans la carte cryo-EM (placées en fonction de la position des segments MPER-N). La structure du trépied (PDB : 6DLN) s'intègre bien dans la carte (à gauche), tandis que les segments MPER-N de la structure tige-bulle (PDB : 6E8W) correspondent mal à la carte cryo-EM car les hélices transmembranaires dépassent loin de la densité du nanodisque (à droite). e Trois cartes cryo-EM de la gp145 intégrée au nanodisque montrant que l'ectodomaine de la gp145 adopte une large gamme d'angles par rapport au plan de la membrane. Les cartes sont représentées sous forme de surfaces semi-transparentes et la structure de l'ectodomaine sous forme de rubans colorés. Les distances ont été mesurées de l'extrémité de l'ectodomaine (résidu Ala662) au centre du nanodisc (indiqué par la ligne pointillée).

Notre structure indique que le segment MPER-N est partiellement enfoui dans la bicouche lipidique (Fig. 1b), conformément à une structure RMN précédente qui montrait que le MPER formait des segments hélicoïdaux immergés dans la membrane14. En raison d'une charnière reliant le MPER-N aux hélices MPER-C14 et du manque de densité fiable pour le segment MPER-C et la région TM, notre carte ne renseigne pas sur la position des segments MPER-C ni sur l'organisation des hélices TM. Cela dit, comme discuté ci-dessous, il est probable que chaque segment MPER-C s'étende vers le centre du trimère Env et que les domaines TM liés à MPER de chaque protomère se rapprochent près de l'axe du trimère triple dans une association lâche ou, alternativement, liée au faisceau TM observé dans deux structures RMN de MPER-TM22,23. Il convient de noter que d'autres études impliquent que les hélices TM dans le pic de trimère natif ne forment pas un trimère rigide24 mais pourraient passer à une telle configuration pendant le processus de fusion virale. Dans l'une des structures RMN (PDB : 6E8W)22, les segments MPER-C forment des hélices quelque peu continues avec leurs domaines TM respectifs, bien que les hélices MPER-C soient déformées et se détournent du triple axe. La région charnière entre les segments MPER-C et -N forme alors de forts coudes, ce qui fait que les segments MPER-N se rapprochent de l'axe triple. Nous appellerons cela la conformation tige-bulle. Dans l'autre structure RMN (PDB : 6DLN)23, ce sont les charnières entre le TMD et le MPER-C qui forment de forts coudes tandis que les segments MPER-C et -N forment une hélice continue qui s'éloigne de la triple hélice, formant une conformation tripode.

Pour comparer la conformation du MPER dans le contexte du trimère Env complet, nous avons mesuré la distance entre l'extrémité N-terminale des segments MPER, c'est-à-dire l'atome Cα du résidu Lys665, entre les protomères adjacents. Dans notre structure cryo-EM, la distance est de 30 Å, tandis que la distance est de 53 Å dans la structure de trépied RMN et de 16 Å dans la structure tige-bulle RMN (Fig. 5a supplémentaire). La mesure a établi que les segments MPER de notre structure adoptent une conformation entre les deux structures RMN. Cependant, les résidus Trp666 des trois protomères MPER-N convergent dans la conformation tige-bulle pour former un noyau hydrophobe, ce qui n'est pas le cas dans la structure cryo-EM (Fig. 5b supplémentaire). De plus, en plaçant les deux structures RMN dans la carte cryo-EM, en utilisant les segments MPER-N comme points d'ancrage, la dimension de la structure du trépied RMN s'intègre beaucoup mieux dans la carte, établissant que cette structure est plus proche de la conformation MPER dans le contexte de la protéine Env entière (Fig. 1d). La différence restante dans la conformation MPER entre la structure du trépied RMN et notre structure cryo-EM est très probablement due aux contraintes imposées au MPER par l'ectodomaine, qui était présent dans l'étude cryo-EM mais manquant dans l'étude RMN.

Le traitement des données de la gp145 intégrée au nanodisc a révélé que l'ectodomaine peut adopter une large gamme d'angles par rapport au plan de la membrane. Pour mieux caractériser la plage d'inclinaison de l'ectodomaine, nous avons effectué des classifications 3D itératives (Fig. 3 supplémentaire), résultant en 20 cartes avec une densité bien définie pour le nanodisque et des caractéristiques suffisantes dans la densité de l'ectodomaine pour ancrer sans ambiguïté le modèle atomique (exemples montrés sur la Fig. 1e). Un film généré à partir des modèles ancrés illustre le degré d'inclinaison que le trimère Env peut subir par rapport à la membrane du nanodisque (film supplémentaire 1). Les cartes montrent que le triple axe de l'ectodomaine peut s'incliner jusqu'à au moins 30 ° par rapport à la normale de la membrane (Fig. 1e et Film supplémentaire 2). En raison de l'inclinaison, la distance de l'ectodomaine à la surface de la membrane augmente jusqu'à 20 Å (Fig. 1e).

Pour mieux comprendre la dynamique de l'ectodomaine sur la membrane, nous avons utilisé des simulations CGMD (Fig. 2a). gp145 a été intégré dans une bicouche POPC contenant 20 % de cholestérol, car la membrane du VIH-1 est connue pour être riche en cholestérol20. Les simulations ont corroboré les résultats cryo-EM en ce sens que l'ectodomaine est très mobile (film supplémentaire 3) et peut s'incliner jusqu'à ~ 63 °. À partir de cinq simulations de 10 μs, l'ectodomaine est en moyenne incliné de 17, 6 ° ± 10, 0 ° mais suppose une large gamme d'inclinaisons (Fig. 2b). Les simulations CGMD montrent également que les MPER sont très dynamiques et quittent occasionnellement le plan membranaire (film supplémentaire 3), mais rien n'indique que les mouvements MPER soient corrélés à l'inclinaison de l'ectodomaine. La conversion des instantanés CGMD en vues atomistiques a également montré que les inclinaisons élevées de l'ectodomaine en soi ne favorisaient pas l'extraction du MPER de la membrane (Fig. 2c).

a Le système de gp145 intégré à la membrane utilisé pour les simulations de dynamique moléculaire à gros grains (CGMD). L'ectodomaine gp145 est représenté en gris, CHR en orange, MPER-N en vert et MPER-C en magenta. La bicouche lipidique est représentée en jaune. b Graphique montrant la distribution des angles d'inclinaison adoptés par l'ectodomaine gp145, résumant les données des cinq répétitions. La ligne pleine représente la moyenne et la bande grise indique l'écart type. La ligne verticale à 18° est l'inclinaison moyenne globale de l'ectodomaine. c Deux instantanés des simulations CGMD convertis en vues de tous les atomes montrant deux ectodomaines gp145 fortement inclinés. L'inclinaison de l'ectodomaine ne semble pas être en corrélation avec le segment MPER-C opposé (flèche) étant soit immergé dans les lipides (panneau supérieur) soit exposé (panneau inférieur).

Les résultats du CGMD ont indiqué que la liaison de bnAb spécifique de MPER à gp145 dépend de deux dynamiques indépendantes, (1) l'inclinaison de l'ectodomaine pour rendre le MPER stériquement accessible au Fab et (2) les mouvements de MPER qui exposent suffisamment l'épitope de la membrane pour favoriser la liaison au Fab. Notre utilisation du bnAb 4E10 structurellement bien caractérisé qui reconnaît la charnière MPER et l'hélice C25,26 a permis de tester cette notion. L'incubation de la gp145 intégrée au nanodisque avec un excès molaire de 100 fois du Fab 4E10 a entraîné la liaison d'environ 20 % des ectodomaines vitrifiés par au moins une molécule de Fab. Les moyennes de projection obtenues par classification 2D de particules colorées négativement ont révélé qu'un à trois Fab pouvaient être liés à une gp145 (Fig. 3a). Après un traitement approfondi des particules vitrifiées liées au Fab, nous avons pu générer des cartes de densité de la gp145 intégrée au nanodisque dans un complexe avec un Fab 4E10 (gp145•1Fab) à une résolution de 8,8 Å, avec deux Fab 4E10 (gp145•1Fab) à une résolution de 8,2 Å et avec trois Fab 4E10 (gp145•1Fab) à une résolution de 3,7 Å (Fig. 3b et Fig. 2 supplémentaire). Malgré la résolution limitée de deux des cartes, qui n'est que d'environ 12 Å dans la région de liaison Fab (Fig. 4b supplémentaire), les caractéristiques de la densité supplémentaire ont révélé qu'elles représentaient les Fab liés et ont permis l'amarrage de la structure cristalline Fab 4E10 (PDB: 1TZG) 25 (Fig. 6 supplémentaire). Remarquablement, les cartes révèlent deux modes distincts dans lesquels le Fab 4E10 spécifique de MPER se lie à gp145. La carte gp145•1Fab illustre le mode de liaison 1, dans lequel le Fab s'étend du nanodisque presque parallèlement à la surface de la membrane mais légèrement éloigné du plan de la membrane dans la même direction que l'ectodomaine et avec le plan du Fab parallèle à celui de la membrane. Dans la carte gp145•2Fab, un Fab 4E10 présente également le mode de liaison 1, mais le second Fab est lié en mode 2, dans lequel le Fab s'étend dans la direction opposée à celle de l'ectodomaine, occupant un espace qui serait normalement celui de la bicouche lipidique. De plus, le plan du Fab est tourné d'environ 90° et est donc presque perpendiculaire au plan de la membrane. Enfin, dans la carte gp145•3Fab, les trois Fab sont liés à gp145 en mode de liaison 2. Comme les trois Fab occupent maintenant l'espace qui serait normalement occupé par la membrane, cette carte ne montre aucune densité qui représenterait le nanodisc.

une image EM représentative à coloration négative de la gp145 intégrée au nanodisque après incubation avec 4E10 Fab (à gauche) et des moyennes de classe 2D montrant la gp145 avec un à trois Fab 4E10 liés (à droite). Barre d'échelle : 50 nm ; longueur des côtés des moyennes : 34 nm. b Cartes Cryo-EM de gp145 avec un, deux et trois Fab 4E10 liés. Les cartes étaient automatiquement segmentées avec la commande "zone de couleur" dans Chimera. L'ectodomaine et le nanodisc sont colorés en gris clair et les Fab 1 à 3 sont colorés en jaune, or et marron, respectivement. Les astérisques indiquent la densité représentant le PG9 Fab utilisé pour la purification.

Pour analyser les cartes à résolution moyenne de la gp145 intégrée au nanodisque en complexe avec un et deux Fab 4E10, nous avons ancré le Fab 4E10 en complexe avec le peptide MPER-C (PDB: 1TZG) 25 (Fig. 6 supplémentaire). La longue région déterminant la complémentarité 3 dans la chaîne lourde (CDRH3) de 4E10 est hautement hydrophobe, et 4E10 utilise ses boucles CDRH1 et CDRH3 pour lier les lipides, ce qui implique que ces CDR forment une surface d'interaction avec la bicouche lipidique. Dans notre structure de la gp145 intégrée au nanodisque, l'ectodomaine est orienté perpendiculairement au plan de la membrane (Fig. 4a). Cependant, pour que le Fab 4E10 puisse se lier à gp145, l'ectodomaine doit être incliné d'environ 25 ° (Fig. 4b). Un angle d'inclinaison similaire a récemment été observé dans une structure cryo-EM de la protéine Env pleine longueur de la souche AMC011 en complexe avec le Fab de VRC42.0121. L'ectodomaine de notre structure gp145•2Fab a montré un angle d'inclinaison similaire d'environ 25 ° (Fig. 4c). Nous avons également mesuré la distance de l'ectodomaine gp145 de la surface de la membrane. Pour gp145 en soi, la distance entre Glu662 (la fin de la répétition heptad C-terminale; CHR) et Trp666 (le début du MPER immergé dans la membrane) est d'environ 10 Å. Dans la structure gp145•1Fab, cette distance passe à ~20 Å. Dans la structure gp145•2Fab, la distance augmente encore jusqu'à ~40 Å pour le second Fab. Nous avons trouvé une distance similaire d'environ 40 Å lorsque nous avons ancré les modèles atomiques d'Env et le complexe du Fab 10E8 lié à son épitope MPER (PDB : 4U6G) dans la carte cryo-EM publiée de l'ectodomaine Env de la souche AMC011 avec deux Fab 10E8 liés (Fig. 4d)21. Collectivement, ces résultats montrent que l'ectodomaine Env en complexe avec les bnAb ciblant MPER est incliné et soulevé de la membrane.

a Le modèle cryo-EM de gp145 seul (ectodomaine en gris, CHR en orange et MPER-N en vert) avec des segments MPER-C ajoutés à partir d'une structure RMN (PDB : 2PV6) montrant que les MPER sont intégrés à la membrane et la distance de l'ectodomaine (résidu Ala662) à la surface de la membrane est d'environ 10 Å. b Modèle de gp145 avec un Fab 4E10 lié (coloré en jaune), montrant que l'ectodomaine est incliné, augmentant sa distance de la membrane à ~ 20 Å, et que le segment MPER-C (magenta) doit être exposé et orienté approximativement perpendiculairement au plan de la membrane (mode de liaison 1). c Modèle de gp145 avec deux Fab 4E10 liés (colorés en jaune et or), montrant que l'ectodomaine reste incliné et que les deux Fab se lient très différemment. Alors qu'un Fab montre le même mode de liaison 1 que dans le panneau (b), le deuxième Fab soulève le segment MPER-C à ~ 40 Å de la membrane, où il s'étend approximativement parallèlement à la membrane (mode de liaison 2) ; ce Fab occupe l'espace normalement occupé par la membrane. d Modèle de gp160 avec deux Fab liés de bnAb 10E8 (colorés en bleu) générés en ancrant la structure cristalline du complexe d'épitopes Fab-MPER 10E8 (PDB : 4U6G) dans la carte cryo-EM du Fab 10E8 lié à la protéine Env de la souche AMC011 (EMDB : 21334). Le modèle montre que l'ectodomaine n'est pas incliné et pourtant à environ 40 Å de la surface de la membrane et que les deux Fab 10E8 se lient à MPER-C de manière similaire au mode de liaison 4E10 1. e Structure Cryo-EM de gp145 avec trois Fab 4E10 liés (colorés en jaune, or et marron) vus parallèles (en haut) et perpendiculaires au plan de la membrane (en bas). Bien qu'ils se lient de manière asymétrique, les trois Fab présentent le mode de liaison 2. Le codage couleur est le même que sur les Fig. 1–3.

Le segment MPER-C (résidus 674–683) lié par le Fab 4E10 adopte une orientation sensiblement différente de celle à l'état non lié. Dans notre structure de gp145 intégrée au nanodisc, les segments MPER-C doivent être principalement parallèles à la membrane et être partiellement immergés dans la bicouche lipidique (Fig. 4a). En revanche, notre modèle pour le complexe gp145•1Fab indique que le segment MPER-C lié par le premier Fab en mode de liaison 1 est extrait de la membrane, l'extrémité C-terminale du MPER restant proche de la surface de la membrane mais le segment MPER-C étant maintenant orienté à un angle d'environ 80° par rapport au plan de la membrane (Fig. 4b). La liaison du deuxième Fab en mode de liaison 2 entraîne une nouvelle élimination du segment MPER-C qui s'étend maintenant presque parallèlement à la membrane mais à une distance proche de 40 Å (Fig. 4c). Cette position du segment MPER-C nécessiterait l'extraction de l'hélice TM et est donc peu susceptible de se produire in situ, mais cela implique que la liaison Fab exerce une force de traction substantielle sur l'hélice TM, entraînant probablement une perturbation de la région transmembranaire et peut-être même une certaine extraction de l'hélice hors de la membrane. Il convient de noter que la réorientation drastique du segment MPER-C observée dans la liaison du deuxième Fab en mode de liaison 2 n'est pas observée dans la structure modélisée de l'ectodomaine Env avec deux Fab 10E8 liés (Fig. 4d). Dans cette structure, les deux segments MPER-C adoptent une conformation similaire à celle observée pour les Fab 4E10 liés en mode de liaison 1 dans les structures gp145•1Fab et gp145•2Fab. La différence dans les structures liées à 4E10 et 10E8 peut être liée à la plus grande hydrophobicité et à la liaison lipidique de la surface d'interaction membranaire de 4E1014,27 et/ou au domaine C-terminal tronqué de gp145 utilisé pour la formation de complexes avec 4E10.

La résolution de 3,7 Å de la carte gp145•3Fab nous a permis de construire un modèle atomique pour l'ectodomaine ainsi que le MPER entier pour l'une des sous-unités et des modèles de base pour les MPER des deux autres sous-unités, révélant ainsi comment le MPER est connecté au premier (Fig. 4e, Fig. 4f et 7a supplémentaires). Cependant, nous n'avons observé aucune densité pour le nanodisc ou les hélices TM, ce qui suggère que la liaison de trois Fab 4E10 entraîne l'extraction complète du trimère du nanodisc. Une mesure directe préalable de la liaison du Fab 4E10 au peptide MPER sur des liposomes mimétiques du virus VIH-1 par calorimétrie de titrage isotherme a révélé un changement d'enthalpie de -25 kcal/mol14. Ce processus exothermique associé à une faible constante de liaison de 1,0 μM Kd, déterminée par résonance plasmonique de surface, suggère une pénalité entropique significative. Bien que nous ne disposions actuellement d'aucune mesure énergétique directe pour l'extraction de la gp41 TM par 4E10 dans le contexte du nanodisque, les méthodes de microscopie à force atomique à molécule unique révèlent que même les protéines transmembranaires multi-passes peuvent être dépliées et extraites de la membrane à des forces (pN) égales ou inférieures à celles médiées par les molécules d'adhésion28. Même si notre carte gp145•3Fab (décrite plus en détail dans le Matériel supplémentaire) représente clairement une situation artificielle, elle nous permet de tirer deux conclusions. Premièrement, dans le contexte de l'ectodomaine, l'épitope MPER reconnu par le bnAb 4E10 reste dans la même conformation que celle observée dans la structure cristalline du Fab 4E10 en complexe avec le peptide MPER (Fig. 7b supplémentaire)26. Deuxièmement, l'extraction membranaire complète du trimère Env lors de la liaison de trois Fab 4E10 illustre la tension que la liaison 4E10 exerce sur le domaine transmembranaire, ce qui peut expliquer l'apparence déformée du nanodisque dans notre carte gp145•1Fab (Fig. 3b).

Pour comprendre l'effet de la liaison de bnAb sur la dynamique Env, nous avons analysé les simulations CGMD de la gp145 intégrée à la membrane et converti des instantanés d'ectodomaines fortement inclinés en modèles atomistiques. Dans de nombreux modèles, la conformation du segment MPER-C était trop différente de celle observée dans la structure cristalline du complexe Fab 4E10 pour permettre un amarrage sans ambiguïté (Fig. 8a supplémentaire). Cette découverte suggère que l'épitope 4E10 peut n'être qu'occasionnellement dans une conformation optimale pour la liaison à l'anticorps. Alternativement, ou en plus, il est concevable que les interactions initiales de l'anticorps puissent être avec seulement une partie de son épitope comme suggéré précédemment13 et que cela catalyse ensuite le repliement de l'ensemble du segment MPER-C pour permettre un engagement complet du Fab avec son épitope entier comme on le voit dans la structure cristalline25,26. De plus, dans presque tous les modèles, le segment MPER-C était orienté de telle sorte que l'amarrage du Fab 4E10 entraînait soit l'intégration partielle du Fab dans la membrane, soit des conflits stériques avec l'ectodomaine (Fig. 8b supplémentaire). Cependant, un instantané a montré le segment MPER-C dans une orientation similaire à celle observée dans notre structure gp145•1Fab et sa conformation a permis l'amarrage du Fab 4E10 (Fig. 5a). Les simulations CGMD du complexe gp145•1Fab intégré à la membrane ont montré que l'ectodomaine adoptait une gamme d'angles similaire à celle observée en l'absence du Fab 4E10 (Fig. 5b et Film supplémentaire 4), mais avec un angle d'inclinaison moyen de 28,7° ± 12,0°, différent de celui de l'ectodomaine sans ligand (17,6° ± 10,0°). De plus, alors que les trois segments MPER-C dans la gp145 sans ligand ont une inclinaison moyenne de 29,0 ° ± 20,7 ° (Fig. 9 supplémentaire) mais semblent se déplacer indépendamment les uns des autres (Fig. 5c et Fig. 10 supplémentaire), dans le cas de gp145 lié au Fab 10E8, les segments MPER-C ont des angles plus distincts (Fig. 5d et Fig. 11 supplémentaire). Le MPER-C lié au Fab est stabilisé à une inclinaison élevée de 64,9 ° ± 10,4 °, similaire à celle dérivée de la carte cryo-EM, ~ 80 ° (Fig. 4b), tandis que le MPER voisin adopte une inclinaison intermédiaire de 42,5 ° ± 15,3 °, potentiellement suffisante pour faciliter la liaison d'un deuxième Fab, et le dernier MPER suppose un faible angle d'inclinaison de 20,6 ° ± 12,7 °, similaire à celui du MPER -C segments dans la gp145 sans ligand.

a Le système de gp145 intégré à la membrane avec Fab 4E10 lié utilisé pour les simulations de dynamique moléculaire à gros grains (CGMD). L'ectodomaine gp145 est représenté en gris, CHR en orange, MPER-N en vert et MPER-C en magenta. Le Fab lié est représenté en or et la bicouche lipidique en jaune. b Graphique montrant la distribution des angles d'inclinaison adoptés par l'ectodomaine gp145 lié au Fab 4E10, résumant les données des cinq répétitions. La ligne continue représente la moyenne et la bande grise indique l'écart type. La ligne verticale à 29° est l'inclinaison moyenne globale de l'ectodomaine. c Angles des trois segments MPER-C par rapport au plan de la membrane adoptés au fil du temps dans l'une des simulations CGMD de gp145 sans ligand, illustrant les mouvements hautement dynamiques et non corrélés des trois segments (voir la Fig. 10 supplémentaire pour les données de toutes les répétitions). d Angles des trois segments MPER-C adoptés au fil du temps dans l'une des simulations CGMD de la gp145 liée au Fab 4E10, illustrant que la liaison Fab stabilise les trois segments MPER-C à différents angles moyens (voir la Fig. 11 supplémentaire pour les données de toutes les répétitions).

Nos structures de gp145 incorporées dans des nanodisques, seules et en complexe avec jusqu'à trois Fab 4E10, mettent en lumière les conditions préalables et les conséquences de la liaison de bnAb au MPER (Fig. 6a). La plupart du temps, l'ectodomaine Env hautement glycosylé protégera le MPER dont l'épitope bnAb est largement immergé dans la membrane. Cependant, nos analyses cryo-EM et CGMD révèlent que l'ectodomaine peut adopter une large gamme d'angles par rapport à la membrane. À un angle d'inclinaison d'environ 25 ° (l'angle observé sur la carte cryo-EM de la gp145 liée au Fab 4E10) ou plus, ce qui se produit pendant environ 24 % du temps (déduit des simulations CMGD de la gp145 sans ligand), un MPER devient accessible à la liaison Fab, qui nécessite également et indépendamment que l'épitope ait une exposition suffisante sur la membrane et adopte une conformation qui permet au moins des interactions de liaison initiales avec l'anticorps. Après l'engagement de l'anticorps avec le MPER partiellement exposé, la liaison complète stabilisera le MPER dans une configuration extraite de la membrane, perturbant ainsi les mouvements indépendants et comparables des protomères MPER qui facilitent autrement les processus d'hémifusion et de fusion en aval (voir ci-dessous). La superposition des Fab liés à l'épitope d'autres bnAb ciblant MPER avec le Fab 4E10 guidé par leurs épitopes respectifs suggère que cela peut être un principe général pour l'activité neutralisante de ces bnAb (Fig. 6b). La liaison des anticorps interfère également avec la fonction Env en exerçant une tension sur les domaines transmembranaires. Bien que nos cartes ne révèlent pas l'effet de cette tension sur les domaines TM, une étude précédente a proposé que la liaison des anticorps puisse perturber le faisceau hélicoïdal putatif formé par les domaines TM21. De plus, la capacité des bnAb anti-MPER à se lier aux configurations Env non ligandées et liées aux récepteurs et à l'état intermédiaire pré-épingle à cheveux (Fig. 12 supplémentaire) offre une fenêtre de temps prolongée pour médier la neutralisation virale.

L'ectodomaine gp145 est représenté en gris, CHR en orange, MPER-N en vert, MPER-C en magenta et le domaine transmembranaire en bleu clair. La bicouche lipidique est représentée en jaune pâle/marron et l'anticorps en jaune vif. a Dans l'orientation verticale de la protéine Env, l'épitope MPER du bnAb 4E10 (indiqué par *) est occlus par l'ectodomaine, le rendant inaccessible au bnAb, et est la plupart du temps non exposé mais enfoui dans la membrane. L'inclinaison de l'ectodomaine rend accessible de manière transitoire le MPER opposé et si cela coïncide avec une exposition au moins partielle de l'épitope, le bnAb peut effectuer les premières interactions. La liaison complète des anticorps modifie à la fois le mouvement MPER sur la membrane et crée une contrainte sur les domaines transmembranaires, empêchant ainsi d'autres changements conformationnels nécessaires à la fusion membranaire. b Alignement structurel des Fab des bnAb ciblant MPER liés à l'Env du VIH-1. Les Fab de bnAbs 4E10 (PDB : 4XC3), DH511 (PDB : 5U3N), 10E8 (PDB : 4U6G) et PGZL1 (PDB : 6O3J) ont été alignés sur la base de l'épitope consensuel MPER (magenta), montrant que tous les bnAb ciblant MPER-C se lient à l'Env du VIH-1 de la même manière. Notez que la surface d'interaction lipidique de 4E10 est plus hydrophobe que celle des autres bnAbs26.

Les mouvements d'inclinaison et de torsion de l'ectodomaine trimère du VIH-1 observés expérimentalement sont cohérents avec les simulations MD. Alors que les mouvements peuvent être anticipés pour les ectodomaines des récepteurs membranaires, en particulier ceux avec des segments TM à passage unique, nous ne sommes pas au courant de résultats empiriques comparables rapportés dans d'autres systèmes. Une précédente étude cryo-EM de la protéine Env dans des environnements mimétiques membranaires a également observé l'inclinaison de l'Env liée à Fab, mais a interprété l'inclinaison observée comme étant principalement le résultat de la liaison Fab21. En revanche, une récente étude cryo-ET des virions natifs du VIH-1 publiée après l'achèvement de ce travail a également révélé que les protéines Env adoptent différents angles d'inclinaison par rapport à la membrane virale29, corroborant ainsi indépendamment nos résultats cryo-EM et CGMD à une seule particule selon lesquels la protéine Env subit des mouvements d'inclinaison en l'absence d'anticorps lié. À cet égard, il est concevable que la coordination de l'amarrage orthogonal à gp120 par le récepteur CD4 du VIH-1 et son co-récepteur (CXCR4 ou CCR5)30 qui amorcent et initient le changement conformationnel requis pour la fusion médiée par gp16031, respectivement, posent des défis atténués par la gesticulation de l'ectodomaine.

Cela dit, il convient de souligner que lors des simulations de MD, le trimère réside à proximité de la membrane virale, obstruant le trépied, pour la majorité de l'analyse. Moins de 10 % des particules individuelles amassées ont été utilisées pour la carte de résolution de 3,9 Å du trimère intégré au nanodisque sans Fabs 4E10 liés. Sans surprise, les autres étaient trop hétérogènes pour permettre la visualisation du trépied MPER, un fait soulignant la notion que le MPER est flexible sur la membrane. Cette vision du MPER comme étant largement immergé dans la membrane est également cohérente avec la proximité de l'ectodomaine gp160 avec la membrane formant un vide sanitaire de 10 Å noté ici (Fig. 1) et dans des données cryo-ET indépendantes29. Ces deux résultats contrastent avec ceux déduits d'une autre étude cryo-ET des trimères BaL Env du VIH-1 sur des particules virales inactivées par l'aldrithiol-2, dans laquelle le MPER semble former un lien en forme de tige entre l'ectodomaine Env et la membrane virale32. La base de cette disparité est actuellement inconnue.

Des études antérieures de RMN sur des clades viraux ont identifié une paire structurellement conservée d'hélices N et C immergées dans les lipides viraux séparées par une charnière avec des articulations en tandem verrouillées par les résidus de coiffage d'hélice requis identifiés à partir de l'analyse de séquence de plus de 20 000 souches virales du VIH-1. La perturbation des deux articulations par la substitution d'alanine de ces coiffes a abrogé à la fois l'hémifusion et la fusion médiées par les souches CD4-dépendantes ainsi que CD4-indépendantes13. En recouvrant simultanément la membrane virale avec ces segments MPER hydrophobes mobiles, moins de déshydratation de la membrane virale est nécessaire pour rapprocher physiquement les bicouches lipidiques solvatées pour assurer la fusion, réduisant ainsi la barrière cinétique élevée requise. De plus, le segment MPER-TM en soi induit une courbure membranaire et une mobilité lipidique également impliquée dans l'hémifusion et la fusion membranaire33. Ces caractéristiques de facilitation de la fusion du MPER sont remarquables, compte tenu de l'ordre de grandeur du nombre inférieur de pointes par virion du VIH-1 par rapport à plusieurs autres virus, y compris la grippe A34. Étant donné que la liaison d'un seul Fab a un impact sur les mouvements de surface de la membrane non seulement du MPER lié, mais également sur ceux des deux autres protomères (Fig. 5d et Fig. 11 supplémentaire) et que la liaison d'un anticorps ou de son fragment Fab semble suffisante pour inactiver le trimère, cette altération du MPER contribue probablement de manière importante à la neutralisation.

Compte tenu du rôle vital du MPER à toutes les étapes de la fusion du VIH-1, la justification du virus pour protéger sa structure de trépied contre l'attaque des anticorps immunitaires est évidente. Alors que l'inclinaison du pic, et éventuellement l'amorçage du CD4, accorde un accès transitoire à un bras Fab d'anticorps, l'immunodominance d'autres sites d'ectodomaines viraux est une stratégie de diversion efficace pour atténuer le ciblage MPER35,36. Nos études antérieures sur l'immunogénicité du MPER ont révélé que si un MPER à surface membranaire était immunogène in vivo37, l'angle d'approche de la majorité des anticorps induits par le vaccin est incompatible avec le bloc stérique imposé par l'ectodomaine. Une future stratégie vaccinale consiste à restreindre les angles d'approche des anticorps à ceux adoptés par les bnAb existants (Fig. 6b) pour lier le MPER natif lors de l'inclinaison. L'énorme différence entre l'efficacité du vaccin contre deux virus à ARN, à savoir le VIH-1 par rapport au CoV-2, est associée à un taux élevé de mutations et à la densité de protection des glycanes du premier par rapport au second38. Cibler le site le plus conservé et le plus accessible du VIH-1 semble donc critique pour le développement de vaccins protecteurs contre le VIH-1, compte tenu du rationnel défini ici.

L'IgG PG9 HRV3C a été exprimée dans des cellules FreestyleTM 293-F (Thermo Fisher Scientific) cultivées en suspension en utilisant le milieu d'expression FreeStyleTM 293. Une culture de 1 L de cellules FreestyleTM 293-F a été transfectée avec un mélange 2:1 (w/w) d'ADN HC: LC PG9 en utilisant PEI 'Max' (Polysciences, Inc). Au bout de 6 jours, les cellules ont été culottées et le surnageant a été chargé sur une colonne de protéine A-Sepharose. L'IgG a été éluée avec de l'acide acétique 0,5 M, la solution neutralisée avec du Tris-HCl 3 M, pH 9,0, et dialysée pendant une nuit contre une solution saline tamponnée au phosphate (PBS; 8 mM Na2HPO4 et 2 mM KH2PO4, pH 7,4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl).

L'IgG 4E10 a été exprimée dans des cellules ExpiTM 293-F (Thermo Fisher Scientific) cultivées en suspension en utilisant le milieu d'expression ExpiTM 293. Une culture de 1 L de cellules ExpiTM 293-F a été transfectée avec un mélange 1: 1 (p/p) d'ADN HC: LC 4E10 en utilisant PEI 'Max' (Polysciences, Inc). Après 4 jours, les cellules ont été culottées et le surnageant a été chargé sur une colonne de protéine G-Sepharose. L'IgG a été éluée en utilisant de l'acide acétique 500 mM, la solution a été neutralisée avec du Tris-HCl 3 M, pH 9,0, et dialysée pendant une nuit contre du PBS. Le Fab 4E10 a été préparé en réduisant 4E10 IgG (15 mg/mL) dans du dithiothréitol 100 mM pendant 1 h à 37 °C, suivi d'une alkylation dans de l'iodoacétamide 2 mM pendant 48 h à 4 °C. L'IgG a ensuite été digérée avec l'endoprotéinase Lys-C (0, 01 μg / μL; Roche Applied Sciences) dans du Tris-HCl 25 mM, pH 8, 5 et de l'EDTA 1 mM pendant 4 h à 37 ° C. La réaction de clivage a été arrêtée avec 1 mM de Nα-p-tosyl-l-lysine chlorométhyl cétone (TLCK) et 0,4 mM de leupeptine, et les produits de clivage ont été passés sur une colonne de protéine A-Sepharose pour éliminer le Fc et l'IgG intacte.

La séquence d'ADN codant pour les résidus 1 à 723 de la protéine Env de la souche BG505 du VIH-1, contenant trois mutations stabilisatrices (Ala501Cys, Thr605Cys, Ile559Pro), un site de glycosylation introduit (Thr332Asn) et un site de clivage amélioré de la furine (REKR à RRRRRR), et le gène de la furine ont été clonés individuellement dans des vecteurs d'expression pEG BacMam. Les plasmides ont été transformés dans des cellules Escherichia coli DH10Bac pour générer de l'ADN de bacmide. Le baculovirus recombinant a été produit par trois cycles d'amplification virale dans des cellules Spodoptera frugiperda Sf9 cultivées dans du milieu Sf-900III SFM à 27 ° C. Pour l'expression des protéines, les baculovirus contenant respectivement l'ADN de la gp145 et de la furine ont été mélangés dans un rapport de 2:1 (v/v) et utilisés pour infecter des cellules FreestyleTM 293-F dans un rapport de 1:10 (v/v). Après 24 h d'infection, du butyrate de sodium a été ajouté aux cultures à une concentration finale de 10 mM, les cultures ont été déplacées de 37 °C à 30 °C et laissées croître pendant 48 h supplémentaires. Les cellules ont été récoltées et lavées dans du PBS additionné d'EDTA 5 mM et d'albumine de sérum bovin à 0,1 % (p/v) (Sigma Aldrich).

Le trimère gp145 a été purifié sur la base de protocoles publiés39 avec de légères modifications. Les cellules FreestyleTM 293-F exprimant gp145 ont été incubées avec PG9 IgG pendant au moins 3 h, lavées avec du PBS et solubilisées avec un tampon de lyse contenant du Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, du NaCl 150 mM, du Triton X-100 à 0,5 % et un cocktail inhibiteur de protéase (Roche). Après centrifugation du lysat cellulaire à 38 400 × g pendant 1 h à 4 °C, le surnageant a été incubé pendant une nuit avec de la résine de protéine A (GenScript) à 4 °C. La résine a été lavée successivement avec 10 volumes de colonne (CV) de tampon de lavage 1 (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, désoxycholate de sodium 0,03 mg/mL, CHAPS 0,1 % p/v), 10 CV de tampon de lavage 2 (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, désoxycholate de sodium 0,03 mg/mL, 0,1 % (p/v) n-dodécyl β-D-maltoside (DDM)) et 10 CV de tampon de lavage 3 (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, désoxycholate de sodium 0,03 mg/mL, DDM 0,1 %, EDTA 2 mM). L'IgG PG9 liée à la résine de protéine A a été digérée en Fab avec la protéase 3C dans le tampon de lavage 3 additionné de 80 mM de L-cystéine (Sigma Aldrich) pendant 4 h à 4 °C. L'éluat a été recueilli, ainsi qu'un lavage de 5 CV avec un tampon SEC (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, désoxycholate de sodium 0,03 mg/mL, DDM 0,05 %). La solution de protéines a été concentrée à l'aide de filtres centrifuges Amicon Ultra 15 ml 100 kDa (Millipore Sigma) et passée sur une colonne d'exclusion de taille Superose 6 (GE Healthcare) en utilisant un tampon SEC.

Les lipides utilisés dans cette étude sont l'extrait de lipides polaires du cerveau, le palmitoyl oléyl phosphatidylcholine (POPC) et le palmitoyl oléyl phosphatidylglycérol (POPG), tous achetés chez Avanti Polar Lipids. Les lipides ont été solubilisés avec du cholate de sodium 20 mM dans Tris-HCl 30 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM avec sonication et mélangés à un rapport molaire de 1,07:1,5:1. Pour la reconstitution en nanodisques, la gp145 purifiée dans du DDM, la protéine d'échafaudage MSP1D1dH5 et la solution lipidique ont été mélangées à un rapport molaire de 1:20:300. Après une incubation de 30 minutes sur de la glace, des Bio-Beads SM-2 (Bio-Rad) ont été ajoutées à 30 % du volume de l'échantillon pour éliminer les détergents. Les Bio-Beads ont été remplacés après 3 h. Une fois le mélange incubé pendant une nuit à 4 ° C avec une rotation constante, les Bio-Beads ont été laissés se déposer par gravité et le surnageant contenant la gp145 intégrée au nanodisc a été collecté.

La gp145 intégrée au nanodisc a été incubée avec 4E10 Fab à un rapport molaire de 1: 100 pendant au moins 3 h. Les échantillons ont été concentrés à l'aide de filtres centrifuges Amicon Ultra 15 ml 50 kDa (Millipore Sigma) et chargés sur une colonne d'exclusion de taille Superose 6 équilibrée avec HEPES 50 mM, pH 7, 4 et NaCl 150 mM. Les fractions de pic contenant la gp145 incorporée dans un nanodisque décorée avec 4E10 Fab ont été regroupées.

L'homogénéité des échantillons a d'abord été évaluée par EM à coloration négative en utilisant du formiate d'uranyle à 0,7 % (p/v) comme décrit40. Pour calculer les moyennes EM de coloration négative, 100 images ont été collectées pour chaque échantillon à l'aide d'une caméra à dispositif à couplage de charge XR16L-ActiveVu (AMT) sur un microscope électronique Philips CM10 (Philips) fonctionnant à une tension d'accélération de 100 kV. Le grossissement calibré était de ×41 513 (grossissement nominal de ×52 000), donnant une taille de pixel de 2,65 Å au niveau de l'échantillon. La défocalisation a été fixée à –1,5 µm. Environ 10 000 particules ont été sélectionnées manuellement pour chaque échantillon à l'aide de la commande e2boxer.py du progiciel EMAN241 et fenêtrées en images de 180 × 180 pixels. Après normalisation de l'image et centrage des particules, les images de particules ont été classées en 100 groupes à l'aide des procédures de classification K-means mises en œuvre dans SPIDER42.

Le complexe gp145 – 4E10 Fab intégré au nanodisc a été réticulé avec BS3 à un rapport molaire de 1: 600 pendant 30 min sur de la glace. La réticulation a été terminée en ajoutant du Tris 50 mM, pH 7,5. L'échantillon a été dialysé contre un tampon avec 50 mM de Tris, pH 7,5, 150 mM de NaCl pour éliminer l'agent de réticulation. L'homogénéité de l'échantillon a été examinée par EM à coloration négative. Pour cryo-EM, la concentration de l'échantillon a été mesurée avec un spectrophotomètre NanoDrop (Thermo Fisher Scientific) et ajustée à 0,2 mg/mL. Des aliquotes de 4 μL ont été appliquées sur des grilles d'oxyde de graphène (GO) légèrement incandescentes (GO sur Quantifoil R1.2/1.3, Cu, 400 mesh, Electron Microscopy Sciences) à l'aide d'un Vitrobot Mark VI (Thermo Fisher Scientific) réglé à 4 °C et 100 % d'humidité. Après 20 s, les grilles ont été buvardées pendant 1 s avec une force de buvardage de -2 et plongées dans de l'éthane refroidi à l'azote liquide. Les ensembles de données Cryo-EM ont été collectés sur un microscope électronique Titan Krios de 300 kV (Thermo Fisher Scientific) équipé d'un détecteur d'électrons K2 Summit (Gatan) à un grossissement nominal de × 29 000 en mode de comptage à super résolution. Après regroupement sur 2 × 2 pixels, la taille de pixel calibrée était de 1, 03 Å au niveau de l'échantillon. Des expositions de 10 s ont été fractionnées en 40 images (0,25 s par image) avec un débit de dose de 8 e–/pixel/s, ce qui a donné une dose totale de 80 e–/Å2. Les données ont été collectées à l'aide de SerialEM43 en « mode ultra-rapide », dans lequel 3 × 3 trous sont exposés en utilisant l'inclinaison du faisceau et le décalage d'image avant de déplacer la scène vers la position suivante44. La plage de défocalisation a été réglée de -1,5 à -2,5 μm. Les paramètres de collecte de données sont résumés dans le tableau supplémentaire 1.

Les 30 404 piles de films de cinq sessions de collecte de données ont été normalisées en gain, corrigées en mouvement, pondérées en fonction de la dose et regroupées sur 2 × 2 pixels dans MotionCorr245. Les paramètres de la fonction de transfert de contraste (CTF) ont été estimés avec CTFFIND4 (réf. 46) implémenté dans RELION-347. Les particules ont été automatiquement sélectionnées sans modèles avec Gautomatch (http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/), extraites en images individuelles, normalisées et soumises à une classification 2D en 100 classes dans RELION-3. Les classes avec de bonnes moyennes 2D ont été combinées, donnant 3 039 896 particules.

L'identification des particules avec les Fab 4E10 liés a été compliquée par la dominance de la densité de l'ectodomaine gp145. Par conséquent, seules les particules des classes 2D montrant des vues latérales claires ont été sélectionnées et utilisées pour générer quatre modèles initiaux à l'aide de l'algorithme ab initio dans cryoSPARC v248. La reconstruction ab initio a généré une carte montrant une densité claire d'un ectodomaine avec trois Fab 4E10 liés, une carte montrant une forte densité uniquement pour l'ectodomaine et deux cartes "indésirables". Les deux premières cartes et l'une des cartes indésirables ont été utilisées comme modèles initiaux pour exécuter deux cycles de raffinement hétérogène dans cryoSPARC v2, résultant en une pile de 362 646 particules montrant une densité claire pour trois Fab 4E10 liés et 1 878 941 particules montrant une densité claire uniquement pour l'ectodomaine.

Les 362 646 particules présentant une densité claire pour trois Fab 4E10 liés ont été soumises à des raffinements ultérieurs homogènes et non uniformes dans cryoSPARC v249, produisant une carte finale à une résolution globale de 3, 66 Å (Fig. 4a supplémentaire).

Les 1 878 941 particules montrant une densité claire uniquement pour l'ectodomaine ont d'abord été soumises à une classification supervisée dans RELION-3, en utilisant deux cartes de référence générées avec l'outil Segger dans Chimera à partir de la carte cryo-EM de la protéine Env du VIH-1 pleine longueur intégrée au nanodisque de la souche AMC011 avec PGT151 Fab et 10E8 Fab liés (EMDB 21332)21. Une carte de référence ne contenait que la densité de l'ectodomaine et du nanodisque, tandis que la deuxième carte de référence incluait également la densité du Fab 10E8. Les 224 730 particules identifiées par cette classification comme ayant Fab lié ont été soumises à une classification 3D supplémentaire. La densité du PG9 Fab qui a été utilisé pour la purification a toujours été masquée. Après une première classification 3D en huit classes, quatre classes montrant une densité Fab claire ont été combinées et soumises à un second tour de classification 3D en quatre classes. Deux des classes résultantes ont montré un ectodomaine avec un Fab 4E10 lié. Ces deux classes ont été combinées et soumises à deux autres cycles de classification 3D en quatre classes. La carte finale contenant 23 538 particules a été affinée par post-traitement pour donner une carte de densité à une résolution globale de 8,8 Å (gp145•1Fab) (Fig. 4a supplémentaire). Une classe de la classification 3D initiale en quatre classes a montré un ectodomaine avec deux Fab 4E10 liés. Cette classe contenait 21 454 particules et la carte a été affinée par post-traitement pour donner une carte à une résolution globale de 8, 2 Å (gp145 • 2Fab) (Fig. 4a supplémentaire).

Les 1 654 211 particules restantes de la classification supervisée initiale ne montrant aucune densité pour 4E10 Fab ont été soumises à une classification supervisée supplémentaire en utilisant comme références deux cartes d'Env avec et sans densité de nanodisque. Les 1 153 408 particules présentant une densité pour le nanodisc ont été soumises à cinq cycles de classification 3D, à chaque étape de classification, les classes avec une densité claire pour l'ectodomaine et le nanodisc ont été sélectionnées et soumises à une classification plus poussée. Enfin, 47 616 particules de deux classes présentant la meilleure densité dans la région MPER ont été combinées et raffinées, suivies d'un raffinement CTF et d'un polissage bayésien50. La carte de densité résultante a été affinée par post-traitement pour obtenir une carte finale à une résolution globale de 3, 9 Å (Fig. 4a supplémentaire).

Le film illustrant la gamme d'orientations que l'ectodomaine peut prendre sur la surface du nanodisque a été généré à partir de cartes expérimentales. Les cartes ont été sélectionnées à partir des cycles successifs de classification 3D des 1 654 211 particules ne montrant aucune densité pour 4E10 Fab. Les cartes ont été sélectionnées en fonction d'un nombre de particules de 1000 particules ou moins (pour identifier autant d'orientations différentes que possible) ainsi que d'une densité de nanodisc bien définie (pour pouvoir déterminer l'orientation de l'ectodomaine par rapport au nanodisc) (Fig. 3 supplémentaire). Ces critères ont donné 20 cartes qui ont été utilisées pour générer le film dans Chimera51.

Pour la gp145 seule, la structure cristalline de l'ectodomaine Env (résidus 31 à 662, PDB : 5I8H) 52 et la structure RMN du segment N du peptide MPER (résidus 663 à 671, PDB : 2PV6) 14 ont été ancrées manuellement dans la carte de densité gp145 à l'aide de la commande "fit in map" dans Chimera. Après avoir fusionné les chaînes, le modèle a été ajusté manuellement dans Coot53 et affiné par rapport à la densité à l'aide de phenix.real_space_refine54 avec des contraintes géométriques et Ramachandran maintenues tout au long. Après avoir retiré les chaînes latérales dans les régions de densité mal définies, le modèle final contient des informations sur le squelette et les chaînes latérales pour les résidus 331–662 et uniquement le pli du squelette pour les résidus 663–671.

Pour le complexe gp145•3Fab, les structures cristallines de l'ectodomaine Env (résidus 31–662, PDB : 5I8H)52, la structure RMN du segment N du peptide MPER (résidus 663–671, PDB : 2PV6)14 et du Fab 4E10 en complexe avec le peptide MPER-C (résidus 672–684, PDB : 4X C3)26 ont été ancrés manuellement dans la carte de densité gp145•3Fab à l'aide de la commande "fit in map" dans Chimera. Après avoir fusionné les chaînes, le modèle a été ajusté manuellement dans Coot et affiné par rapport à la densité à l'aide de phenix.real_space_refine avec des contraintes géométriques et Ramachandran maintenues tout au long. Après avoir retiré les chaînes latérales dans les régions de densité mal définies, le modèle final contient des informations sur le squelette et les chaînes latérales pour les résidus 31 à 662, et uniquement le pli du squelette pour les résidus 663 à 684 (sauf pour conserver les chaînes latérales du résidu 678 dans la chaîne B et les résidus 664, 671 et 674 dans la chaîne D.

Les modèles ont été affinés par rapport à la demi-carte 1, et les courbes FSC ont ensuite été calculées entre le modèle affiné et la demi-carte 1 (travail), la demi-carte 2 (libre) et la carte combinée (Fig. 4c, e supplémentaires).

Pour les simulations de gp145 sans ligand, un modèle a été construit en reliant la structure cryo-EM de l'ectodomaine (cette étude) à la structure RMN du domaine transmembranaire MPER comprenant les sept premiers résidus du domaine cytoplasmique (PDB : 6DLN). La protéine a été placée dans une bicouche lipidique constituée de POPC et de cholestérol à un rapport molaire de 4:1, et le système a été solvaté dans du NaCl 150 mM en utilisant le script insane.py55.

Des simulations à gros grains ont été mises en place à l'aide de Martinize2 (https://github.com/marrink-lab/vermouth-martinize) et du dernier modèle de champ de force MARTINI356. La structure quaternaire et tertiaire a été conservée en appliquant un réseau élastique au modèle CG, avec une constante de force de 500 kJ mol−1 nm−2 et des distances de coupure supérieure et inférieure de 0,9 nm et 0,5 nm, respectivement57. Toutes les simulations ont été réalisées avec GROMACS 2020.6 (réf. 58, 59) et l'algorithme saute-mouton60 a été utilisé pour intégrer les équations newtoniennes de mouvement avec un pas de temps de 20 fs. Les simulations ont été réalisées à l'aide du schéma de coupure de Verlet pour la recherche de voisins, mis à jour toutes les 20 étapes61. Les interactions électrostatiques ont été calculées à l'aide de Reaction-Field, avec une distance de coupure de Coulomb de 1,1 nm62. Le thermostat de remise à l'échelle de vitesse a été utilisé pour maintenir la température à 310 K63. Le couplage de pression pour les simulations d'équilibrage et de production a été réalisé à l'aide du barostat Berendsen64 et du barostat Parrinello-Rahman65, respectivement. Cinq simulations, à partir de graines aléatoires uniques, ont été réalisées avec des phases d'équilibrage de 4, 75 ns et des cycles de production de 10 μs chacune.

Pour les simulations de gp145 dans un complexe avec 4E10 Fab, un instantané a été pris à partir d'une simulation de gp145 sans ligand qui a montré une conformation MPER-C similaire à celle du modèle cryo-EM de la gp145 liée au Fab 4E10. Cet instantané à gros grains a été converti en une vue de tous les atomes à l'aide du script back.py66 et du convertisseur CHARMM-GUI All-atom67. Le modèle atomistique résultant a été utilisé pour ancrer la structure du Fab 4E10 (PDB: 4XC3), guidé par le peptide MPER-C lié au Fab, avec des ajustements mineurs pour éviter les conflits stériques avec l'ectodomaine gp145. La protéine a été placée dans une bicouche lipidique constituée de POPC et de cholestérol à un rapport molaire de 4: 1, et le système a été solvaté dans du NaCl 150 mM en utilisant le script insane.py.

Des simulations à gros grains ont été mises en place et exécutées comme décrit pour la gp145 sans ligand. Un réseau élastique a été appliqué avec les mêmes paramètres que ceux décrits ci-dessus. Des interactions de réseau élastiques ont également été appliquées entre le Fab 4E10 et le segment MPER-C pour maintenir les interactions de liaison. Cinq simulations, à partir de graines aléatoires uniques, ont été réalisées avec des phases d'équilibrage de 6, 75 ns et des cycles de production de 1 μs chacune.

Les trajectoires de simulation ont été centrées à l'aide de gmx trjconv. gmx gangle a été utilisé pour mesurer les angles de l'ectodomaine gp145 et des segments MPER-C. Les trajectoires ont été visualisées à l'aide de VMD v.1.9.4a12 (réf. 68) et les graphiques ont été réalisés à l'aide de Microsoft Excel.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données à l'appui de cette étude sont disponibles auprès des auteurs correspondants sur demande raisonnable. Les cartes cryo-EM ont été déposées dans la banque de données de microscopie électronique (EMDB) sous les codes d'accession EMD-25022 (gp145), EMD-25024 (gp145•1Fab), EMD-25025 (gp145•2Fab) et EMD-25045 (gp145•3Fab). Les coordonnées atomiques ont été déposées dans la Protein Data Bank (PDB) sous les codes d'accession 7SC5 (gp145) et PDB-7SD3 (gp145•3Fab). Les codes d'accession PDB précédemment rapportés utilisés sont les suivants : 1TZG (4E10 Fab/MPER), 2PV6 (segment N du peptide MPER, RMN) ; 4U6G (10E8 Fab/MPER); 4XC3 (4E10 Fab/peptide MPER-C); 5I8H (ectodomaine Env); 5U3N (DH511 Fab/MPER); 6DLN (trépied MPER); 6E8W (tige-bulle MPER); 6O3J (PGZL1 Fab/MPER). Les codes d'accession EMDB précédemment rapportés utilisés sont les suivants : EMDB-21332 (AMC011 avec PGT151 Fab lié et 10E8 Fab) et EMDB-21334 (AMC011 avec 10E8 Fab lié).

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Nous remercions M. Ebrahim, J. Sotiris et H. Ng du centre de ressources Evelyn Gruss Lipper Cryo-EM de l'Université Rockefeller pour leur aide à la collecte de données cryo-EM. Nous remercions le Dr P. Cesar Telles de Souza de nous avoir fourni un fichier de topologie bêta MARTINI3 pour le cholestérol. Ce travail a été soutenu par la subvention P01 AI126901 (ELR, TW) des National Institutes of Health.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Shuang Yang, Giorgos Hiotis.

Laboratoire de microscopie électronique moléculaire, Université Rockefeller, New York, NY, États-Unis

Shuang Yang, George Hiotis et Thomas Walz

Programme de doctorat tri-institutionnel en biologie chimique, Université Rockefeller, New York, NY, États-Unis

Giorgos Hiotis

Laboratoire d'immunobiologie, Département d'oncologie médicale, Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA, États-Unis

Yi Wang, Junjian Chen, Jia-huai Wang, Mikyung Kim et Ellis L. Reinherz

Département de médecine, Harvard Medical School, Boston, MA, États-Unis

Yi Wang, Junjian Chen et Ellis L. Reinherz

Département de chimie biologique et de pharmacologie moléculaire, Harvard Medical School, Boston, MA, États-Unis

Jia-huai Wang

Département de biologie du cancer, Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA, États-Unis

Jia-huai Wang

Département de pédiatrie, Harvard Medical School, Boston, MA, États-Unis

Jia-huai Wang

Département de dermatologie, Harvard Medical School, Boston, MA, États-Unis

Mikyung Kim

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ELR et TW ont conçu l'étude. SY, GH, MK, ELR et TW ont conçu les expériences. SY, YW et JC ont préparé des Fab d'anticorps. SY a réalisé toutes les expériences de biochimie et de biologie structurale. GH a effectué toutes les expériences de dynamique moléculaire. Expériences supervisées par JHW, MK, ELR et TW. Tous les auteurs ont analysé les résultats. SY, ELR et TW ont rédigé le manuscrit.

Correspondance à Ellis L. Reinherz ou Thomas Walz.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Tyler Reddy et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

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Réimpressions et autorisations

Yang, S., Hiotis, G., Wang, Y. et al. Le mouvement dynamique des pointes du VIH-1 crée une vulnérabilité de son trépied lié à la membrane aux attaques d'anticorps. Nat Commun 13, 6393 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-34008-y

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Reçu : 09 mai 2022

Accepté : 06 octobre 2022

Publié: 27 octobre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-34008-y

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