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Aug 07, 2023

Un transporteur candidat permettant aux dinoflagellés symbiotiques de nourrir leurs hôtes coralliens

ISME Communications volume 3,

ISME Communications volume 3, Numéro d'article : 7 (2023) Citer cet article

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Le partenariat symbiotique entre les coraux et les algues dinoflagellées est crucial pour les récifs coralliens. Les coraux fournissent à leurs symbiotes algaux un abri, du dioxyde de carbone et de l'azote. En échange, les algues symbiotiques fournissent à leurs hôtes animaux du carbone fixe sous forme de glucose. Mais comment le glucose est transféré du symbiote algal à l'animal hôte est inconnu. Nous avons estimé qu'un transporteur résidant dans la membrane cellulaire des dinoflagellés faciliterait le transfert vers l'extérieur du glucose vers le tissu animal hôte environnant. Nous avons identifié un transporteur candidat chez le symbiote cnidaire dinoflagellé Breviolum minutum qui appartient à la famille omniprésente des uniporteurs de sucre facilitateurs connus sous le nom de SWEET (les sucres seront éventuellement des transporteurs exportés). Des analyses d'expression génique antérieures avaient montré que BmSWEET1 est régulé positivement lorsque les algues vivent en symbiose dans un hôte cnidaire par rapport à l'état de vie libre [1, 2]. Nous avons utilisé la microscopie par immunofluorescence pour localiser BmSWEET1 dans la membrane cellulaire des dinoflagellés. Des tests de préférence de substrat dans un système de transport de substitution de levure ont montré que BmSWEET1 transporte le glucose. La microscopie quantitative a montré que les cellules symbiotiques de B. minutum ont significativement plus de protéine BmSWEET1 que les cellules libres de la même souche, ce qui correspond à l'exportation pendant la symbiose mais pas pendant la phase planctonique libre. Ainsi, BmSWEET1 est au bon endroit, au bon moment, et a le bon substrat pour être le transporteur avec lequel les algues dinoflagellées symbiotiques nourrissent leurs hôtes animaux pour alimenter les récifs coralliens.

La symbiose est une stratégie évolutive puissante qui combine des ensembles de compétences d'espèces distinctes pour relever les défis de la sélection environnementale en tant que consortium. Dans le cas des récifs coralliens, le partenariat permet une croissance abondante dans des eaux pauvres en nutriments qui, autrement, ne supporteraient que très peu de biomasse [3]. Les symbioses de récifs coralliens sont remarquablement réussies. Bien que les récifs n'occupent que 0,1 % du milieu marin, ils abritent plus de 33 % de la diversité marine [4].

Les algues symbiotiques des coraux utilisent le CO2 et l'énergie lumineuse pour fabriquer des sucres par photosynthèse. Le sucre est nourri au corail, et ce « transfert de devises » symbiotique [5] sous-tend la capacité de la plupart des coraux à déposer du carbonate de calcium et ainsi à construire un récif [3]. À son tour, l'hôte corallien fournit à ses symbiotes algaux un abri, du CO2 et de l'azote précieux. Le transfert de carbone fixé par photosynthèse du symbiote à l'hôte a été démontré il y a plus de 60 ans par Muscatine et Hand [6], et les symbiotes fournissent jusqu'à 90 % de l'énergie utilisée par un corail [3]. Les premiers travaux, qui utilisaient des symbiotes retirés de l'hôte, indiquaient que le glycérol était la principale exportation [7]. Cependant, des études récentes utilisant des partenariats intacts montrent que le glucose est la principale exportation et suggèrent que la libération de glycérol par les symbiotes est soit un artefact induit en les isolant de leur hôte [8,9,10], soit peut-être transporté dans la vacuole du symbiosome en tant qu'osmolyte [11]. Ainsi, nous savons quelle forme de photosynthate est transférée et combien de transfert se produit, mais nous ne savons pratiquement rien sur la façon dont le transfert se produit.

Le photosynthate transféré doit traverser au moins deux membranes : la membrane cellulaire des algues ; et le soi-disant symbiosome, une membrane semblable à une vacuole créée lors de l'absorption phagocytaire d'un symbiote par un hôte [12]. Étant donné que le glucose est imperméable à la membrane, il existe probablement des transporteurs dans l'une ou les deux membranes pour déplacer le glucose vers l'extérieur. Nous émettons l'hypothèse qu'au moins un transporteur se trouvera dans la membrane cellulaire du symbiote et sera principalement actif dans l'hôpital. Pour identifier le ou les transporteurs, nous avons précédemment comparé l'expression génique dans des cellules libres et symbiotiques de Breviolum minutum [1], un symbiote dinoflagellé de coraux et d'anémones [13]. Plusieurs transporteurs ont montré une expression accrue dans l'hôpital [1], et un, que nous appelons BmSWEET1, est davantage caractérisé ici.

Des anémones de mer Exaiptasia diaphana de génotype AIMS3 [13] ont été conservées dans une pièce à température constante à une température constante de 26 ° C, avec un cycle de photopériode lumière: obscurité de 12 h 12 et des photons de 15 μmol m −2 s −1 (les anémones GBR sont sensibles à la lumière et préfèrent des conditions de faible luminosité [13]), ainsi qu'un apport d'air constant. Les anémones ont été maintenues dans trois récipients en plastique de 2,4 L avec de l'eau de mer (Red Sea Salt, salinité de 34 ppt), dans les mêmes conditions. Les anémones ont été nourries à volonté deux fois par semaine avec des Artemia sp. les nauplii (éclos pendant la nuit sous un apport d'air constant) et les algues filamenteuses ont été éliminés avant les changements d'eau complets hebdomadaires.

Des cellules de B. minutum ont été isolées et cultivées à partir d'une seule anémone E. diaphana génotypée [14]. Trois sous-cultures répétées ont été générées dans des flacons de culture cellulaire (capuchon ventilé à membrane de 0, 2 μm) avec de l'eau de mer filtrée à 0, 2 μm (FSW) complétée par 1 x milieu IMK de Diago (Novachem). Les cultures ont été conservées dans une chambre de croissance (LED 740FHC, HiPoint) à une température constante de 26 ° C, un cycle de photopériode lumière: obscurité de 12:12 h et des photons de 60 μmol m -2 s -1. Les cultures ont été régulièrement surveillées par microscopie optique pour évaluer leur santé (les cellules sont intactes, vitales et des cellules mobiles sont présentes). Les sous-cultures répétées ont été conservées et maintenues pendant au moins six mois avant les extractions de protéines et l'échantillonnage pour l'immunofluorescence.

La séquence d'acides aminés de BmSWEET1 a été déduite du transcriptome de B. minutum (GICE01031994) [1]. La masse moléculaire a été calculée à l'aide de l'outil ExPASy Compute PI/MW (https://web.expasy.org/compute_pi/). Les domaines transmembranaires putatifs ont été prédits à l'aide des programmes Phobius [15] et HMMTOP [16]. Une structure prédite de BmSWEET1 a été générée à l'aide de ColabFold [17] et superposée à la structure résolue du riz OsSWEET2b [18] à l'aide de ChimeraX [19].

L'antisérum contre BmSWEET1 a été produit à l'aide de peptides antigéniques synthétiques (Mimotopes) et des services de Walter and Eliza Hall (WEHI) Antibody Facility (Bundoora, VIC). Anti-BmSWEET1 a été dirigé contre le peptide RKKPDENSPVSPS conjugué à l'hémocyanine de patelle et utilisé pour immuniser deux lapins différents dans un programme d'immunisation et de saignée de 82 jours, qui comprenait un total de quatre rappels. Les IgG des sérums de lapin ont été purifiés à l'aide d'une colonne d'affinité (WEHI) et l'immunoréactivité (efficacité et spécificité) contre l'antigène a été évaluée par ELISA (WEHI) et western blot (voir ci-dessous).

La protéine a été extraite des cultures de B. minutum comme décrit [20] avec les modifications suivantes. Les cellules de 20 ml de culture ont été culottées par centrifugation à 15 000 tr/min pendant 1 min, puis lavées avec du FSW. Une deuxième centrifugation a été suivie d'une remise en suspension avec du FSW avec 2% de Triton X100 (Sigma). Cette étape a été répétée deux fois. Le culot a ensuite été remis en suspension avec un tampon d'extraction (Tris 100 mM, EDTA 10 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4) additionné d'un inhibiteur de protéase (cocktail PI complet sans EDTA de Roche). Les cellules ont été homogénéisées à l'aide de billes de verre lavées à l'acide de 710 à 1180 mm (Sigma) et d'un TissueLyser II (Qiagen) pendant 90 s à 30 Hz. Les billes ont été retirées et l'homogénat a été centrifugé à 15 000 tr/min pendant 5 min à 4 °C. Le surnageant a été conservé et la concentration en protéines a été déterminée à l'aide du kit de dosage des protéines Qubit, conformément aux instructions du fabricant (ThermoFisher).

Un échantillon de protéines de 20 à 30 μg a été bouilli (70 ° C, 10 min) avec un tampon d'échantillon Bolt LDS (ThermoFisher) et un agent réducteur d'échantillon Bolt (ThermoFisher) dans un volume total de 40 à 50 μl. Les protéines ont été séparées sur du gel Bolt 4–12% Bis-Tris Plus (ThermoFisher) et transférées sur une membrane de nitrocellulose conformément aux instructions du fabricant. La membrane a été bloquée pendant une nuit avec du lait écrémé à 5 % dans du tampon TBS (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, base Tris 24,8 mM, pH 7,4) contenant 0,05 % de Tween20 (TTBS). La membrane a été buvardée avec l'anticorps primaire pendant 1 h, puis lavée trois fois avec du TTBS pendant 5 min, puis incubée avec de l'IgG anti-lapin Amersham ECL conjuguée à la peroxydase de raifort (Bio-Strategy). Trois lavages supplémentaires de 5 min ont été effectués avant d'exposer la membrane aux réactifs SuperSignal West Pico PLUS pendant 5 min (ThermoScientific).

Pour vérifier la spécificité de l'antisérum, le sérum a été pré-incubé avec l'antigène peptidique (rapport molaire 1: 1) pendant 1 h sous agitation à température ambiante avant le transfert Western comme ci-dessus.

Trois répliques de cellules de B. minutum libres et symbiotiques cultivées (fraîchement isolées à partir d'anémones [1]) ont été marquées pour l'immunofluorescence soit avec un anti-BmSWEET1, du sérum pré-immun, soit aucun anticorps primaire suivi de lavages et d'un secondaire, anticorps marqué fluorescent comme ci-dessous.

Deux ml (~ 1 × 106 cellules) de chacun des trois flacons répliqués ont été échantillonnés pour l'immunofluorescence quantitative [16]. Les cellules ont été culottées par centrifugation à 15 000 tr/min, 1 min, et lavées avec 2 ml de FSW. Les cellules ont été fixées par incubation avec du paraformaldéhyde à 4 % (Electron Microscopy Sciences) dans un tampon salin tamponné au phosphate (PBS) (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,8 mM), pendant 3 h à 4 °C. Pour la perméabilisation, les cellules ont été incubées avec du Triton X100 à 0,1 % dans du PBS pendant 10 min. Les cellules ont été culottées et lavées trois fois avec du Tween20 à 0,1 % (Bio-Rad) dans du PBS (PBST). Ensuite, le blocage de la liaison non spécifique a été réalisé en incubant avec 1 % d'albumine de sérum bovin (BSA) (Sigma) dans du PBST pendant 2 h. En outre, le culot de cellules a été mis en suspension avec l'anticorps primaire dilué dans 0, 1% de BSA dans du PBST et incubé pendant une nuit à 4 ° C. Après trois lavages avec du PBST, les cellules ont été mises en suspension avec de l'IgG anti-lapin de chèvre, Alexa Fluor 546 (ThermoScientific) 1:500 dans du BSA à 0,1 % dans du PBST, pendant 2 h, dans l'obscurité. Enfin, les cellules ont été incubées avec du DAPI (ThermoScientific) 1:100 dans du BSA à 0,1% dans du PBST, pendant 10 min, dans l'obscurité.

Les cellules symbiotes ont été isolées à partir de 20 à 30 anémones de taille moyenne de génotype AIMS3, par homogénéisation avec un homogénéisateur en verre et plusieurs rotations (~ 10) à 15 000 tr/min, 1 min, et lavages avec FSW. Cette procédure a minimisé les cellules hôtes dans l'homogénat résultant. Le reste du protocole IFA était le même que celui décrit ci-dessus pour les symbiotes cultivés.

Cinq µl d'échantillon ont été chargés sur des lames imprimées en PTFE (fournitures SPI) avec ProLong™ Glass Antifade Mountant (ThermoScientific) et visualisés sur un microscope confocal inversé Nikon A1R. Les images ont été acquises à l'aide de filtres DAPI et TRITC.

La quantification de l'intensité du signal a été réalisée en analysant davantage les images via le logiciel Fiji (ImageJ) [21], ce qui nous a permis de comparer le signal BmSWEET1 comme indicateur de la quantité de protéines. Des cellules sélectionnées au hasard (au moins 100 cellules) de chacun des trois réplicats et de chaque traitement ont été identifiées en fonction de leur forme, de leur taille et de l'autofluorescence de la chlorophylle. Ensuite, l'intensité moyenne de la tache autour de la cellule a été déterminée sur la base de la fluorescence de l'anticorps secondaire. Aucune différence significative n'a été observée dans l'épaisseur de la paroi cellulaire des cellules d'algues libres par rapport aux cellules symbiotiques (Fig. S1), nous supposons donc que l'accès aux réactifs de marquage est équivalent.

L'analyse statistique pour la microscopie quantitative a été effectuée à l'aide du logiciel SPSS (version 20.0., IBM Corp). Les données ont été testées pour la normalité et l'égalité des variances. Pour distinguer les résultats statistiquement significatifs, nous avons utilisé l'analyse ANOVA à deux voies suivie d'un test de comparaisons multiples post hoc (Tukey HSD) (p < 0,05).

Trois contrôles négatifs d'immunofluorescence ont été réalisés. Le premier impliquait un marquage avec un sérum pré-immun, qui n'a donné aucun signal (non représenté). La seconde était la préincubation du sérum avec l'antigène peptidique (rapport molaire 1: 1) pendant 1 h avec agitation à température ambiante avant d'ajouter le sérum aux lames, ce qui n'a entraîné aucun signal BmSWEET1 jaune (non illustré). Le troisième contrôle négatif consistait à omettre l'anticorps primaire.

Les séquences codantes de AtSWEET1 (AT1G21460) et AtSWEET11 (AT3G48740) ont été amplifiées à partir de l'ADNc d'Arabidopsis thaliana à l'aide des amorces SF46/SF47 et SF52/SF53 (tableau S1), respectivement. La séquence d'ADNc de BmSWEET1 a été optimisée en codons pour Saccharomyces cerevisiae et synthétisée par Integrated DNA Technologies. Des fragments de gènes synthétisés ont été utilisés pour la PCR avec les amorces SF50/SF51. Les fragments de PCR ont été sous-clonés dans pJet1.2 (Thermo Fisher Scientific) et vérifiés par séquençage. Après digestion par PacI et XhoI, les fragments ont été ligaturés dans le vecteur d'expression de levure pDR195 [22].

La souche de levure EBY4000 [hxt1–17D::loxP gal2D::loxP stl1D::loxP agt1D::loxP ydl247wD::loxP yjr160cD::loxP], un mutant dans plusieurs importateurs d'hexose [23], a été transformée avec les différents vecteurs pDR195 - contenant soit AtSWEET1, AtSWEET11, BmSW EET1 en insert, ou le vecteur pDR195 sans insert respectivement comme décrit [24]. Les transformants ont été sélectionnés sur milieu YNB + \({{{\mathrm{NH}}}}_{4^{+}}\), +His, + Trp, +2% Mal, -Ura, et vérifiés par PCR.

Pour tester l'activité d'absorption du glucose, les différentes souches de levure ont été précultivées pendant une nuit dans du milieu YNB (+ His, + Trp, + 2 % Mal) à 30 °C, 160 tr/min. Pour EBY4000, Ura a été ajouté au milieu. Les cellules ont été récoltées par centrifugation (2500 × g, 10 min, température ambiante) et lavées deux fois avec du tampon TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA). La densité optique a été ajustée à OD600 = 3. Les souches de levure ont été déposées sous forme de dilution en série sur des plaques de milieu YNB avec ou sans Ura et complétées avec 2 % de Mal ou de Glc comme source de carbone. De plus, l'effet de 0,2 % de 2-désoxy-D-glucose a été testé. La croissance a été documentée par photographie après 3 jours d'incubation à 30 °C ou 5 jours d'incubation à 30 °C avec Fru comme source de carbone.

BmSWEET1 (GICE01031994) présente une similitude de séquence élevée avec les membres d'une famille de transporteurs connue sous le nom de SWEET (les sucres seront éventuellement des transporteurs exportés) (Fig. 1A). Les SWEET ont été découverts pour la première fois dans les plantes [25], où leurs rôles incluent l'exportation de sucres des feuilles pour les transporter jusqu'aux racines non photosynthétiques, le chargement de sucres dans les graines pour donner aux nouvelles plantes un début de vie et la sécrétion de sucres dans les nectaires de fleurs pour attirer les pollinisateurs [25, 26]. Depuis leur découverte initiale dans les plantes, les SWEET ont ensuite été identifiés chez les animaux [27], les champignons [28], les protistes [28, 29] et les bactéries [28, 29]. Les SWEET eucaryotes sont apparemment nés de la fusion de deux demi-transporteurs procaryotes connus sous le nom de semi-SWEET [28]. La structure des SWEET eucaryotes, avec deux faisceaux en triple hélice connectés via une hélice de liaison d'inversion (c'est-à-dire sept domaines transmembranaires) [18, 28], est cohérente avec la fusion de deux gènes semi-SWEET [18, 28]. Les SWEET sont des uniporteurs bidirectionnels qui facilitent la diffusion des sucres dans un gradient de concentration [25, 30]. Chez les plantes, les substrats peuvent être le glucose, le fructose et le saccharose [25, 30].

Un alignement de BmSWEET1 avec OsSWEET2b (riz SWEET2b) montrant des niveaux élevés de similarité de séquence (* [astérisque] indique des positions avec un résidu entièrement conservé, : [deux-points] indique une conservation entre des groupes de propriétés fortement similaires, et. [point] indique une conservation entre des groupes de propriétés faiblement similaires [19]). Deux domaines MtN3 dans BmSWEET1 sont indiqués par des barres roses. Les hélices transmembranaires prédites dans BmSWEET1 sont indiquées par du texte gris. La tyrosine 61 (verte) à la porte extrafaciale de OsSWEET2b (17) est conservée dans BmSWEET1, tout comme trois des quatre prolines (rouges) tapissant le tunnel du substrat OsSWEET2b (17). La paire d'asparagine (n minuscule) au niveau du site de sélection du substrat dans OsSWEET2b (17) n'est pas évidente dans BmSWEET1 à partir de cet alignement. Le peptide utilisé pour produire le sérum anti-BmSWEET1 est indiqué par une ligne rouge. B Structure résolue du riz OsSWEET2b montrant sept hélices transmembranaires [18]. C ColabFold a prédit la structure de BmSWEET1 montrant huit domaines transmembranaires. La position approximative du peptide utilisé pour générer l'antisérum BmSWEET1 est indiquée par une ligne rouge. D Superposition des structures OsSWEET2b (beige) et BmSWEET1 (bleu) montrant une colinéarité étendue plus un domaine transmembranaire N-terminal supplémentaire (côté droit) dans BmSWEET1.

BmSWEET1 a des caractéristiques de structure primaires d'un SWEET eucaryote typique, à savoir deux domaines MtN3/salive et sept hélices transmembranaires prédites [18, 25] ; un huitième domaine transmembranaire possible est prédit dans une extension N-terminale de BmSWEET1 non partagée avec les plantes SWEET (Fig. 1A). L'alignement [31] de BmSWEET1 avec le riz SWEET2b (OzSWEET2b) montre un niveau élevé d'identité de séquence (Fig. 1A) et des caractéristiques conservées telles que la tyrosine à la porte externe [18, 25] et trois des quatre prolines qui bordent la voie de transport [18, 25], sont évidents dans BmSWEET1 (Fig. 1A). Cependant, la paire de résidus d'asparagine entourant le site de reconnaissance du substrat de glucose dans OsSWEET2b [18] n'est pas évidente dans BmSWEET1 (Fig. 1A). Nous avons utilisé Alpha Fold [17] pour prédire une structure de BmSWEET1 (Fig. 1C) et nous avons comparé la structure prédite de la protéine dinoflagellée avec la structure résolue pour le riz, OsSWEET2b [18] (Fig. 1B). AlphaFold a corroboré l'existence de huit domaines transmembranaires dans BmSWEET1 (Fig. 1C). La structure BmSWEET1 prédite est très similaire à la structure OsSWEET2b [18] avec sept hélices transmembranaires se chevauchant presque exactement (Fig. 1D). La transmembrane supplémentaire (huitième) prédite dans la protéine BmSWEET1 se trouve du côté droit de cette vue (Fig. 1C) et entraînerait une extrémité N-terminale interne, ce qui contraste avec la protéine de riz dans laquelle l'extrémité N-terminale est extracellulaire [18]. Quel rôle joue la transmembrane supplémentaire (huitième) dans BmSWEET1, et si BmSWEET1 existe en tant qu'homotrimère comme le transporteur facilitateur du glucose du riz [18], reste à déterminer. Néanmoins, la similitude des deux protéines (Fig. 1D) est remarquable étant donné que les dinoflagellés et les plantes ont partagé pour la dernière fois un ancêtre commun il y a environ 2 milliards d'années [32]. Sur la base de l'analyse de séquence et de la modélisation de la structure, nous considérons qu'il est extrêmement probable que BmSWEET1 soit un uniporteur de sucre bidirectionnel avec une ou des préférences de substrat indéterminées.

Cinq gènes supplémentaires de type SWEET sont également évidents dans les ressources génomiques de B. minutum [2] (tableau S1). Aucun d'entre eux n'a été régulé positivement en hospite [1], et ils ne sont pas davantage caractérisés ici. Il est important de noter que nous avons également trouvé des gènes de type SWEET dans d'autres dinoflagellés symbiotiques pour lesquels des ressources génomiques sont disponibles (tableau S1).

WoLF PSORT prédit que BmSWEET1 est une protéine de membrane cellulaire [33], et notre prochaine étape consistait à localiser la protéine. Des antisérums dirigés contre un peptide (RKKPDENSPVS) unique à BmSWEET1 (Fig. 1A, C) décorent une seule bande avec une masse apparente de 54 kDa dans des transferts Western de protéines de B. minutum séparées par SDS-PAGE (Fig. 2A). La préincubation du sérum avec le peptide a supprimé la liaison du sérum à cette bande (Fig. 2B), démontrant que le sérum est spécifique du peptide BmSWEET1. La masse apparente de BmSWEET1 est en accord raisonnable avec la masse prédite (35 kDa) étant donné que les protéines membranaires migrent souvent de manière aberrante en SDS-PAGE [34].

A L'antisérum peptidique marque une seule bande de masse moléculaire 56 kDa dans les cellules en culture. Le marquage B est abrogé par la préincubation du sérum avec le peptide antigénique. C Dix cellules de B. minutum en culture marquées au DAPI en bleu. D Antisérum BmSWEET1 en jaune. E Autofluorescence de la chlorophylle en rouge. F Eclairage fond clair. G Fusion de tous, montrant BmSWEET1 à la périphérie des cellules et non associé aux noyaux ou aux plastes. H Gros plan d'une seule cellule cultivée de B. minutum colorée avec du calcofluor pour la cellulose en magenta. I Même cellule que H marquée pour BmSWEET1 en jaune, J Même cellule que H montrant l'autofluorescence de la chlorophylle en rouge. K Même cellule que H en éclairage fond clair. L Fusion de calcofluor et BmSWEET1 montrant la protéine BmSWEET1 sous-tendant principalement la paroi cellulosique. M Micrographie électronique d'une cellule de B. minutum illustrant la membrane cellulaire située juste sous la paroi cellulaire.

Les tests d'immunofluorescence utilisant ce sérum montrent que BmSWEET1 est situé à la périphérie des cellules de dinoflagellés et non associé aux noyaux bleus colorés au DAPI (Fig. 2C). BmSWEET1 est distal par rapport à l'autofluorescence de la chlorophylle rouge définissant les plastes et probablement pas une protéine membranaire des chloroplastes (Fig. 2E – J). La co-coloration avec du calcofluor blanc, que nous avons utilisé pour colorer la cellulose magenta, révèle que la protéine BmSWEET1 est située au niveau ou juste en dessous de la paroi cellulaire externe (Fig. 2H – M), très probablement dans la membrane cellulaire des dinoflagellés. Nous concluons que BmSWEET1 est principalement une protéine de membrane cellulaire (membrane plasmique) de B. minutum.

Pour déterminer si BmSWEET1 est effectivement un transporteur de sucre et quel est son substrat préféré, nous avons appliqué le test de complémentation de mutant de levure largement utilisé [18, 25, 26, 28]. Le mutant de transporteur d'hexose de levure EBY4000 ne peut pas importer de glucose et ne se développe pas sur de la gélose au glucose [23]. EBY4000 peut être transformé avec le plasmide d'expression pDR195, qui conférera la capacité de se développer sur des milieux de glucose s'il exprime un importateur de glucose. Étant donné que les SWEET sont des facilitateurs bidirectionnels capables de transporter les sucres de concentrations élevées à faibles, la levure exprimant un SWEET fonctionnel peut absorber certains sucres du milieu [18].

Les transformants exprimant BmSWEET1, Arabidopsis thaliana SWEET1 (un transporteur de glucose [25]), AtSWEET11 (un transporteur de saccharose d'Arabidopsis [26]) et le vecteur pDR195 vide (ne contenant pas de gène transporteur) ont été sélectionnés sur un milieu SD solide avec 2% de maltose comme source de carbone à 30 ° C pendant 4 jours, puis déposés en série de dilutions sur des plaques de maltose ou de glucose, toutes deux sans uracile pour sélectionner pDR1 95 contenant des souches (pDR195 exprime également l'orotidine-5'-phosphate décarboxylase [URA3], qui est nécessaire à la biosynthèse de l'uracile).

Toutes les souches ont poussé sur des plaques de maltose additionnées d'uracile (Fig. 3A). EBY4000 non transformé ne s'est pas développé sur des plaques de maltose dépourvues d'uracile (Fig. 3B). Comme prévu, les levures vecteurs vides (pDR195) ont pu se développer sur les plaques de maltose (Fig. 3A, B), mais pas sur les plaques de glucose (Fig. 3C). De même, les levures exprimant AtSWEET11 se sont développées sur les plaques de maltose (Fig. 3A, B) mais pas sur les plaques de glucose (Fig. 3C), ce qui est cohérent avec le fait qu'AtSWEET11 est un transporteur de saccharose [26]. Inversement, la levure exprimant le transporteur de glucose connu AtSWEET1 [25] a poussé sur le glucose (Fig. 3C). La levure exprimant BmSWEET1 a également poussé sur du glucose (Fig. 3C), confirmant que BmSWEET1 est un transporteur de glucose.

Une souche de levure non transformée EBY4000 et des souches transformées avec le plasmide d'expression pDR195 hébergeant le transporteur de glucose Arabidopsis AtSWEET1, le transporteur de saccharose Arabidopsis AtSWEET11, ou le transporteur putatif B. minutum BmSWEET1, ou un vecteur vide poussent tous sur des plaques de maltose (Mal) complétées avec de l'uracile (Ura). B Si l'uracile est omis des plaques de maltose, les mutants non transformés (EBY4000) ne se développent pas car ils sont auxotrophes pour l'uracile. C Si le maltose est remplacé par du glucose (Glc), seule la levure exprimant un importateur de glucose peut survivre, à savoir les transformants AtSWEET1 et les transformants BmSWEET1. D Inversement, si le substrat de maltose est complété par un analogue de glucose toxique (2-dexoy-D-glucose), toutes les souches compétentes pour l'importation d'hexose (c'est-à-dire les transformants AtSWEET1 et les transformants BmSWEET1) mourront, tandis que les souches incompétentes pour l'importation d'hexose (AtSWEET11 et vecteur vide pDR195) peuvent se développer à l'aide de maltose et ne sont pas empoisonnées par le 2-dexoy-D-glucose. E Lorsque le fructose (Fru) est fourni comme source de carbone, les transformants AtSWEET1 (qui peuvent importer du fructose) se développent, tout comme les transformants BmSWEET1 à un degré moindre. Les images de l'ensemble des plaques de la série de dilution sont présentées sur la figure S1.

Comme test supplémentaire du transport du glucose par BmSWEET1, nous avons utilisé l'analogue de glucose toxique 2-désoxy-D-glucose (Fig. 3D). Les transformants de levure étalés sur maltose plus 2-désoxy-D-glucose meurent s'ils sont compétents pour l'importation de glucose. Ainsi, les levures exprimant AtSWEET1 ou BmSWEET1 ne se sont pas développées dans ce test alors que celles exprimant AtSWEET11, ou aucun transporteur (vecteur vide) se sont développées avec succès car elles ne pouvaient pas absorber l'analogue de glucose toxique (Fig. 3D).

Nous avons également testé la capacité de BmSWEET1 à transporter le fructose (Fig. 3E). Les levures exprimant AtSWEET1 ont poussé sur le fructose comme prévu [35], et une croissance limitée des levures exprimant BmSWEET1 était également évidente sur le fructose (Fig. 3E), indiquant une certaine capacité de BmSWEET1 à transporter le fructose. Nous concluons que le substrat optimal du transporteur BmSWEET1 est le glucose.

Nous avons ensuite cherché à corroborer les preuves du transcriptome selon lesquelles BmSWEET1 est plus abondant lorsque les algues sont symbiotiques au sein d'un hôte animal [1, 2] en utilisant notre antisérum pour mesurer les niveaux de protéines. Comme les autres SWEET, BmSWEET1 est apparemment un facilitateur non régulé de la diffusion passive, donc exprimer un exportateur de glucose à l'état planctonique libre semblerait inadapté. Il est peu probable que les cellules libres exportent du précieux glucose vers l'océan, et la fuite de glucose dans l'environnement pourrait également attirer des prédateurs algivores [36]. Inversement, on s'attendrait à ce que les cellules symbiotiques expriment plus de BmSWEET1 pour remplir leur part de «l'échange de devises» symbiotique [5].

Nous avons tenté de mesurer la quantité de BmSWEET1 dans les algues libres et symbiotiques à l'aide de Western Blot, mais le manque d'anticorps dirigés contre d'autres protéines de dinoflagellés exprimées de manière constitutive à utiliser comme contrôle de chargement, et des niveaux de fond élevés dans les transferts de symbiotes isolés (apparemment causés par la contamination par des anémones) ont évité cette approche. Nous avons donc décidé de quantifier le marquage par immunofluorescence de BmSWEET1 dans des cellules individuelles, soit des cellules de B. minutum libres, soit des cellules symbiotiques de la même souche fraîchement isolées de l'anémone hôte E. diaphana (Fig. 4).

Cellules AC Breviolum minutum cultivées in vitro. D–F Cellules de la même souche fraîchement isolées d'anémones hôtes. Les deux ensembles de cellules ont été immunocolorés pour la protéine BmSWEET1 et imagés en parallèle pour comparer les intensités de marquage. Un marquage BmSWEET1 dans des cellules libres montrant un marquage BmSWEET1 relativement faible est représenté en jaune. B Eclairage fond clair. C Fusion de tous. D B. minutum cellule symbiotique dans une anémone hôte montrant un marquage BmSWEET1 intense. E Eclairage fond clair. F Fusion de tous. G – J L'immunocoloration des deux populations (vivant en liberté par rapport à l'hôpital) a été réalisée trois fois, et l'intensité du marquage a été mesurée pour> 100 cellules (n) et représentée sous forme de tracés en boîte / moustaches. G Intensité de fluorescence dans les cellules libres. H Intensité de fluorescence des cellules hospitalières. I, J L'intensité de fluorescence de fond a été quantifiée en nombres équivalents de cellules préparées de manière similaire mais sans l'antisérum primaire et est légèrement inférieure à celle mesurée pour les cellules libres marquées avec l'anticorps primaire (comparer G).

Le marquage des anticorps et l'imagerie des deux échantillons d'algues ont été effectués en parallèle avec les mêmes conditions et réglages de microscope (Fig. 4A – F). L'étiquetage et les comparaisons quantitatives ont été effectués à trois reprises et l'intensité de fluorescence de> 100 cellules a été quantifiée pour chaque traitement (Fig. 4G – J). Le marquage de base / de fond a été établi en omettant l'antisérum BmSWEET1 primaire (Fig. 4I, J). La quantification montre que les algues ont significativement plus de protéine BmSWEET1 à l'hôpital (Fig. 4H) qu'elles n'en ont lorsqu'elles vivent en liberté (Fig. 4G). Pour contrôler l'accessibilité différentielle des anticorps aux cellules libres par rapport aux cellules symbiotiques fraîchement isolées, nous avons mesuré l'épaisseur de la paroi cellulaire, ce qui a montré que l'épaisseur médiane de la paroi ne différait pas dans les deux groupes (Fig. S2). Les dinoflagellés symbiotiques existent à une intensité lumineuse plus faible (15 μmol m-2 s-1 photons) que leurs homologues vivants libres et cultivés in vitro (60 μmol m-2 s-1 photons, voir Matériels et méthodes). Pour contrôler que l'intensité lumineuse n'affectait pas la quantité de protéine BmSWEET1, nous avons effectué une immunofluorescence sur deux cultures : une cultivée à 60 μmol m-2 s-1 photons et une autre à 15 μmol m-2 s-1 photons. Aucune différence significative dans le marquage par immunofluorescence BmSWEET1 n'a été observée à différentes intensités lumineuses in vitro (Fig. S3).

Fait intéressant, les niveaux de marquage à l'état libre (Fig. 4G) sont à peine supérieurs aux témoins négatifs dans lesquels l'antisérum primaire a été omis (Fig. 4I, J), ce qui est cohérent avec notre hypothèse d'expression minimale de BmSWEET1 au cours de cette phase de vie pour minimiser l'exportation inutile de glucose ou le danger d'attirer les algivores [36]. On pense que les facteurs sécrétés par l'hôte induisent l'exportation de carbone fixe à partir de symbiotes de dinoflagellés [37,38,39], et divers agents pathogènes des plantes sont capables de réguler positivement les SWEET des plantes pour accéder au sucre de l'hôte [40], il sera donc intéressant de déterminer ce qui cause l'expression accrue de BmSWEET1 dans l'hôpital.

Nous concluons que BmSWEET1 est régulé positivement, et peut-être plus stable, dans les algues symbiotiques, ce qui est cohérent avec le fait qu'il est un exportateur de glucose capable de nourrir son hôte.

Nous nous sommes concentrés sur un transporteur de glucose putatif, BmSWEET1, dans le dinoflagellé symbiotique B. minutum dont il avait été précédemment démontré qu'il était régulé positivement au niveau de l'expression génique en milieu hospitalier par rapport à la vie libre [1]. L'analyse de séquence et la modélisation de la structure ont suggéré que BmSWEET1 est un transporteur de sucre facilitateur qui aiderait le sucre à diffuser vers le bas d'un gradient de concentration. Nous avons localisé BmSWEET1 sur la membrane cellulaire du symbiote. Nous avons montré que BmSWEET1 transporte le glucose en complémentant un mutant de levure déficient en importation d'hexose. Enfin, nous avons montré par microscopie quantitative que les dinoflagellés de B. minutum vivant dans des anémones hôtes hébergent sensiblement plus de BmSWEET1 dans leurs membranes cellulaires que les cellules libres de la même souche.

BmSWEET1 possède ainsi trois propriétés qui en font un candidat probable pour l'exportateur symbiotique de glucose dans les symbioses dinoflagellés-invertébrés : i/ emplacement approprié (membrane cellulaire d'algue), ii/ bon substrat (glucose), et iii/ niveau d'expression nettement plus élevé en hospite. Avec la photosynthèse des dinoflagellés comme source de glucose et la respiration de l'animal hôte comme puits de glucose, BmSWEET1 est une passerelle idéale pour faciliter la diffusion du glucose de l'endosymbionte vers son hôte et ainsi nourrir les coraux pour soutenir la création de récifs coralliens.

Les matériaux décrits dans le manuscrit, y compris toutes les données brutes pertinentes, sont disponibles gratuitement sur demande.

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Cette étude a été soutenue par des subventions à la découverte du Conseil australien de la recherche (DP160101539 à GIM et MvO, DP210100639 à GIM et DP180102630 à MJHvO) et des bourses lauréates du Conseil australien de la recherche (FL170100008 à GIM et FL180100036 à MJHvO). APMW et ME apprécient le soutien de la Fondation allemande pour la recherche, via CRC1535 "MiBiNet". Nous remercions Eckhard Boles d'avoir fourni la souche EBY4000.

Cool Maor-Landaw

Adresse actuelle : Département de biologie marine, École des sciences marines Leon H. Charney, Université de Haïfa, Haïfa, Israël

Marion Eisenhut

Adresse actuelle : Biologie computationnelle, Faculté de biologie, CeBiTec, Université de Bielefeld, Bielefeld, Allemagne

Jade Tortorelli

Adresse actuelle : Coral Resilience Lab, Hawai'i Institute of Marine Biology, Kāne'ohe, HI, USA

École des biosciences, Université de Melbourne, Parkville, VIC, Australie

Keren Maor-Landaw, Giada Tortorelli, Allison van de Meene, Madeleine JH van Oppen & Geoffrey I. McFadden

Institut de biochimie végétale, Cluster of Excellence on Plant Sciences (CEPLAS), Heinrich-Heine-University, Universitätsstraße 1, D-40225, Düsseldorf, Allemagne

Marion Eisenhut, Samantha Kurz et Andreas PM Weber

Plateforme de microscopie optique biologique, Université de Melbourne, Parkville, VIC, Australie

Gabriela Segal

Institut australien des sciences marines, Townsville, QLD, Australie

Madeleine JH van Oppen

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KM-L, ME, MJHvO, APMW et GIM ont contribué au développement conceptuel et à la version finale éditée du manuscrit. KM-L, ME, GT, AvdM, SK et GS ont mené les expériences. KM-L, ME, MJHvO, APMW et GIM ont rédigé le manuscrit.

Correspondance à Geoffrey I. McFadden.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Maor-Landaw, K., Eisenhut, M., Tortorelli, G. et al. Un transporteur candidat permettant aux dinoflagellés symbiotiques de nourrir leurs hôtes coralliens. ISME COMMUN. 3, 7 (2023). https://doi.org/10.1038/s43705-023-00218-8

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Reçu : 02 novembre 2022

Révisé : 10 janvier 2023

Accepté : 18 janvier 2023

Publié: 28 janvier 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s43705-023-00218-8

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